不同灸量小艾炷灸肝俞穴對原發(fā)性肝癌模型大鼠癌前病變期TNF-α、AFP的影響

王 寧,譚 麗,侯中偉

(1.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院,廣東 深圳 518107; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。2012年，全球范圍內(nèi)男性肝癌的發(fā)病率和死亡率分居第5位和第2位，女性肝癌的發(fā)病率和死亡率分居第7位和第6位[1]。中國肝癌死亡率分別占同期全球第3位，同期中國死亡38萬人，占同期中國癌癥死亡總數(shù)的17.4%[2]。2013年我國仍有36.2萬人確診肝癌[3]。因此，降低原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率在肝癌防治過程中起著關(guān)鍵的作用。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)[4-5]，艾灸在治療肝病進(jìn)程中存在著明確的臨床療效。故本實(shí)驗(yàn)在采用二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)建立HCC肝癌模型的同時(shí)，用不同灸量的小艾炷干預(yù)模型大鼠，觀察艾灸肝俞穴對HCC模型癌前病變期大鼠血清中腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、甲胎蛋白(Alphafetoprotein,AFP)含量的影響以及肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的變化，比較不同灸量之間的效果差異，尋求最佳灸量。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

55只清潔級Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(200±10)g，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(10只)、模型組(15只)、艾灸1組(15只)、艾灸2組(15只)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠均飼養(yǎng)于溫度為20℃～25℃濕度為55%左右的動物房。實(shí)驗(yàn)用大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK京2012-0001。

1.2 主要試劑、藥品和設(shè)備

試劑：蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，TNF-α、AFP檢測試劑盒(北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；藥品：麻醉劑采用濃度為1.5%的戊巴比妥鈉,DEN溶液(濃度為0.95 g/mL，購于美國Sigma公司，批號Sigma-N0756)；儀器：AnymicroDSSTM圖像采集系統(tǒng)和德國LEICARM2245型石蠟切片機(jī)；艾絨(型號：80:1)。

1.3 模型制備

本實(shí)驗(yàn)采用DEN腹腔注射法復(fù)制HCC模型[6]。首先將濃度為0.95 g/mL的DEN溶液溶于0.9% Nacl溶液中，配制成濃度為10 mg/mL的溶液。然后根據(jù)大鼠體質(zhì)量，按照50 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射。注射頻次為：2次/周，期間間隔3～4天或84 h，連續(xù)10周。HCC模型造模成功的主要標(biāo)志為肝臟病理組織切片可見肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，肝板消失，細(xì)胞核深染，核/質(zhì)比增大，異型性增加，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象，局部誘導(dǎo)出腫瘤灶；解剖可見肝臟質(zhì)地變硬，體積明顯萎縮變小，表面出現(xiàn)大量大小不一的結(jié)節(jié)，或見腹水，或見肺部及胃部出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；形態(tài)出現(xiàn)形體消瘦、體重減輕、行動遲緩等。

2 方法

2.1 干預(yù)方法

模型組和對照組大鼠只做固定處理，不做艾灸。艾灸1組、艾灸2組的大鼠注射完濃度為10 mg/mL的DEN溶液后，固定于動物臺上，采用小艾炷灸肝俞穴，分別按照3壯/穴、6壯/穴的灸量進(jìn)行干預(yù)，每隔1日1次，連續(xù)艾灸10周。具體艾灸方法為：將艾絨做成1/4麥粒大小的小艾炷(呈圓錐形)，重量約5 mg/壯；剃除艾灸組大鼠穴區(qū)3 cm×2 cm(長×寬)的鼠毛，暴露穴位周圍皮膚。待大鼠固定后，將小艾炷放置在大鼠兩側(cè)肝俞穴上點(diǎn)燃，艾炷燃滅后，更換艾炷再次施灸。大鼠肝俞穴的定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]的標(biāo)準(zhǔn)取穴。

2.2 取材與檢測

造模完成后，所有大鼠尾靜脈取1.5 mL血置于肝素抗凝管中，靜置2 h后，離心15 min，轉(zhuǎn)速為3 500 r/min。離心后取250 μL血清裝入凍存管，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)每只大鼠的體重，按0.25 mL/100 g的劑量腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取出肝臟，切取肝臟組織并浸泡于甲醛溶液中，1周后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片，最后采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝臟組織的病理變化。血清TNF-α、AFP的測定采用ELisa(酶聯(lián)免疫吸附法)檢測。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠造模后血清TNF-α、AFP含量的比較

造模結(jié)束后，與對照組相比，模型組血清TNF-α、AFP含量均明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，艾灸1組血清TNF-α、AFP含量均明顯血清(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。艾灸2組降低TNF-α、AFP含量均降低(P>0.05)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；艾灸1組與艾灸2組相比，TNF-α、AFP含量無明顯變化(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后TNF-α、AFP的含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；實(shí)驗(yàn)過程中大鼠有死亡，故樣本數(shù)少于初始量。

3.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化

對照組大鼠肝細(xì)胞胞漿胞核均勻,肝細(xì)胞索排列整齊，呈放射狀，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型組細(xì)胞核深染，異型性增加，核/質(zhì)比增大，小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象；艾灸1組存在少量肝板，核/質(zhì)比略增大，肝細(xì)胞有雙核，細(xì)胞核異型性低；艾灸2組，細(xì)胞核深染、核/質(zhì)比增大，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，肝細(xì)胞有雙核。見封三彩圖1。

4 討論

從歷代文獻(xiàn)記載可以發(fā)現(xiàn)，灸法在防治腫瘤方面歷史悠久。原發(fā)性肝癌在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)屬“癥瘕”“積聚”“臌脹”等范疇。《景岳全書·卷二十三》記載:“……但察其脈絡(luò)所由者，皆當(dāng)按其處而通灸之，火力所到，則其堅(jiān)聚之氣自然以漸解散”，不僅說明灸法能夠散結(jié)化滯，而且說明艾灸達(dá)到有效的灸量才能產(chǎn)生最佳的效果。有研究表明[8],灸法在肝癌防治過程中的各個(gè)階段都有積極的作用。背俞穴是臟腑之氣匯聚之處，《靈樞·背腧第五十一》指出：“按其處，……乃其俞也。灸之則可，刺之則不可。氣盛則瀉之，虛則補(bǔ)之”,說明背俞穴可以采用灸法對所屬臟腑補(bǔ)虛瀉實(shí)。根據(jù)《素問》“治臟者治其俞，治腑者治其合”的中醫(yī)治療原則，取肝俞穴能夠直接、快速、有效地激發(fā)肝臟的氣血，調(diào)節(jié)臟腑陰陽。而且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)瘢痕灸肝俞穴對HCC的效果要優(yōu)于足三里穴[9]。在多種肝癌模型中,DEN誘發(fā)肝癌癌前病變的階段性特征與人類病程類似[10],故本實(shí)驗(yàn)采用DEN復(fù)制HCC模型，并在造模的同時(shí)采用不同灸量的小艾炷灸干預(yù)，從而觀察不同艾灸肝俞穴對HCC模型大鼠癌前病變期血清中TNF-α、AFP及肝臟組織形態(tài)的影響。

TNF-α是一種具有促炎活性和免疫調(diào)節(jié)功能的炎癥因子，在腫瘤微環(huán)境中的組成性表達(dá)是許多惡性腫瘤的共同特征。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過多種途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及遷移，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)途徑：①TNF-α與其受體結(jié)合后，通過激活caspase級聯(lián)反應(yīng)通路、NF-κB信號等通路，促進(jìn)細(xì)胞分裂，進(jìn)一步加快肝癌細(xì)胞的增殖[11-14];②TNF-α在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)TNC的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移[15];③TNF-α通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[16];④通過TNF-α/ROS/HIF-1途徑明顯上調(diào)肝癌細(xì)胞中 FoxM1的表達(dá)并增強(qiáng)其啟動子的活性，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡[17];⑤TNF-α介導(dǎo)的線粒體解偶聯(lián)作用可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移[18]。可以發(fā)現(xiàn)TNF-α是通過多種途徑調(diào)控著肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡與遷徙。

AFP來源于胚胎的干細(xì)胞,在臨床上不僅是肝癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)記物，當(dāng)作診斷肝癌的主要標(biāo)準(zhǔn)[19]，而且還可以結(jié)合活檢、腹水等指標(biāo)提高HCC惡性程度及預(yù)后的預(yù)測[20-21]。研究表明[22-23]：AFP是一種免疫抑制性蛋白質(zhì)，具有免疫抑制作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長, 并且AFP可以誘導(dǎo)肝癌患者T細(xì)胞和B細(xì)胞的自發(fā)應(yīng)答， AFP疫苗可以作為腫瘤治療的潛在工具。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清TNF-α、AFP含量要明顯高于對照組，而有直接灸干預(yù)的大鼠血清TNF-α、AFP含量要低于模型組，有降低趨勢，說明直接灸能夠降低HCC大鼠血清TNF-α、AFP的含量，直接灸在一定程度上能夠抑制大鼠HCC細(xì)胞的增殖。結(jié)合光鏡下肝臟組織切片HE染色的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直接灸組肝癌細(xì)胞的異型性、核固縮要少于模型組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①直接灸肝俞穴能夠?qū)CC模型大鼠癌前病變期TNF-α、AFP及肝臟組織形態(tài)有良性調(diào)節(jié)作用，在一定程度上能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖；②兩組直接灸中，艾灸1組的效果更好，但與艾灸2組比較，組間無差異，可能跟樣本量的大小、艾灸干預(yù)的周期等有關(guān)，需進(jìn)一步研究；③直接灸肝俞穴對HCC的作用機(jī)制可能與艾灸抑制肝細(xì)胞中TNF-α介導(dǎo)的相關(guān)信號通路有關(guān)。因此可以認(rèn)為，直接灸能夠適當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且灸量對肝癌細(xì)胞的影響存在差異。