針?biāo)幏▽Ω咧Y模型大鼠血管保護(hù)作用對比研究*

周海純，郭蕊珠 ,王艷麗，趙海深，孔德鳳，蔡國鋒

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱市急救中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江護(hù)理高等?？茖W(xué)校,黑龍江 哈爾濱 150301；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

高脂血癥是動脈硬化主要危險因素之一，同時是導(dǎo)致腦梗死、腦出血等腦血管疾病的主要誘發(fā)因素[1]，在我國隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，該病發(fā)病率逐年上升，并且趨于年輕化，目前國內(nèi)醫(yī)藥市場對于高脂血癥的治療尚缺乏特效藥物，臨床治療以西藥，如羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、煙酸類調(diào)脂藥、膽固醇合成抑制劑和膽汁酸螯合劑等藥物為主，長期服用肝腎損害極大。北方地區(qū)由于生活區(qū)域氣候寒冷，飲食以肉食、酒食為主，高脂血癥頻發(fā)，歷代醫(yī)生在長期與疾病的斗爭中，協(xié)定處方調(diào)脂飲經(jīng)過大量研究，臨床療效確切，目前是臨床治療高脂血癥及預(yù)防心腦血管疾病的重要手段[2-3]。在臨床應(yīng)用廣泛，治療效果顯著，同時在長期臨床工作中發(fā)現(xiàn)微針扶正祛邪。實則祛痰飲、通脈絡(luò)，虛則補肝腎虧損，調(diào)脾胃。針?biāo)幉⒂茫噍o相成，增加療效。故采取此次實驗研究，奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇健康成年SPF級SD大鼠雌雄各半，共計120只，大鼠體重分布為(200±20)g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK (吉)2012-0009。實驗動物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，清潔級，控制適宜溫度，保持適合濕度。

1.2 試驗藥品

1.2.1 調(diào)脂飲組成 調(diào)脂飲為新疆藥王王仁老先生自擬經(jīng)驗方，藥物由丹參、荷葉各15 g,山楂35 g,甘草15 g,何首烏10 g、枸杞、菊花、虎杖、蟬蛻各15 g,共9味藥物組成。

1.2.2 調(diào)脂飲功效 主要治療高脂血癥，功效為改善血脂水平、調(diào)整脂質(zhì)代謝。

1.2.3 調(diào)脂飲顆粒制備 第一步：浸膏制備。以上共同煎煮2次，2 h/次，將濾液濃縮，制成浸膏，控制相對密度1.10～1.15，控制溫度60℃。

第二步：稠膏制備。將浸膏冷卻，達(dá)到室溫后選擇乙醇溶液攪拌均勻，混合物質(zhì)要求乙醇百分比達(dá)到50%，16 h后抽取混合物質(zhì)上清液，并將乙醇回收，制成稠膏，控制相對密度1.20～1.25，控制溫度60℃[4]。

第三步：顆粒制備。將上述制備的稠膏，分別混合固定比例的蔗糖、糊精攪拌均勻，風(fēng)干處理，顆粒制備完成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備。儲存，灌胃使用。

1.3 試驗儀器

日立7180型全自動生化分析儀；TGL-19臺式高速冷凍離心機；電熱恒溫水浴箱；MP2000D 電子天平。

1.4 試驗造模及分組

預(yù)實驗采取血清記錄實驗前基礎(chǔ)值;華佗牌針灸針(0.3×40 mm,蘇州魯躍醫(yī)療器械有限公司)，108只SPF級SD大鼠高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)時間持續(xù)45天，檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C，確定造模成功大鼠，選擇60只隨機分為模型組、對照組、針?biāo)幗M，共3組。

1.5 干預(yù)方法

模型組：灌胃，灌胃等體積標(biāo)準(zhǔn)蒸餾水。1次/日。

對照組: 調(diào)脂飲低劑量，顆粒稀釋，灌胃標(biāo)準(zhǔn)0.45 g·kg，1次/日。

針?biāo)幗M：調(diào)脂飲，顆粒稀釋，灌胃標(biāo)準(zhǔn)0.45 g·kg，1次/日。微針取穴：豐隆、足三里、中脘、脾俞;微針刺法：捻轉(zhuǎn)進(jìn)針，得氣后留針20 min，每10 min行針1次，1次/日。

1.6 調(diào)脂飲急性毒理試驗

開展高劑量的調(diào)脂飲急性毒理試驗，檢驗調(diào)脂飲方劑的安全性。

1.7 熒光定量PCR檢測

引物設(shè)計與常規(guī) PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank已發(fā)表的大鼠Hes5、Mash1、Ngn1、Ngn2序列和β-Actin的序列，應(yīng)用Premier5. 0設(shè)計5對引物。

上游引物 Hes1-F 5′-ATGCCAGCTGATATTGG-3′;下游引物 Hes1-R 5′-GGCGGGGTGCGCCTGCCCGGGG-3′。

引物設(shè)計與常規(guī) PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank 已發(fā)表的大鼠Hes1序列和β- actin的序列，應(yīng)用 Premier5.0設(shè)計2對引物，PCR產(chǎn)物長度分別為480 bp(目的基因的片段長度)和640 bp(內(nèi)參基因的片段長度)。上游引物β-Actin-F 5′-CGTTGACATCCGTAGACCTC-3′;下游引物β-Actin-R 5′-GGGAGGGTGAGGGACTTCCTGT-3′。

PCR反應(yīng)采用50 μL 體系:10×Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物各1 μL、Taq酶1 μL、模板2 μL、ddH2O 36 μL。

具體步驟如下：第一步驟：選擇95℃預(yù)變性5 min;第二步驟：選擇95℃再次變性30 s；第三步驟：選擇55℃退火持續(xù)30 s； 第四步驟：選擇72℃延伸持續(xù)45 s； 第五步驟：選擇30個循環(huán)；第六步驟：選擇72℃延伸持續(xù)10 min。第七步驟：選擇1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳實驗用來檢測完成的PCR產(chǎn)物。

1.8 總RNA質(zhì)量檢測

細(xì)胞的總RNA用Trizol法提取，所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，采用分光光度法測定RNA的濃度和純度。實驗中所得樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0范圍之內(nèi)，并根據(jù)OD260計算濃度，調(diào)整RNA的濃度為500 ng/μL；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表示，28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2∶1，說明實驗中所抽提得到的總RNA質(zhì)量較好，無降解，可以滿足后續(xù)實驗的要求。見圖1。

表1 對血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的影響

注：與模型組比較,AP<0.05,BP<0.01,CP>0.05;與對照組比較,**P<0.05,***P<0.01,*P>0.05。

圖1 總RNA的質(zhì)量檢測

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C比較

高脂血癥大鼠模型針?biāo)幗M大鼠與對照組，TC、TG、HDL-C、LDL-C比較(P均<0.01)，提示造模成功。

表1顯示：高脂血癥大鼠經(jīng)過單純給藥與針?biāo)幹委熀?，TC、TG含量均有明顯改善，與模型組相比，均具有極顯著差異(P<0.01)。高脂血癥大鼠經(jīng)過針?biāo)幗M和對照組治療均有效，但針?biāo)幗M與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。因此針?biāo)幗M和對照組治療高脂血癥大鼠均有效。

針?biāo)幗M、對照組與模型組相比，HDL-C含量均升高趨勢;對照組HDL-C含量未能達(dá)到正常水平。而針?biāo)幗M效果顯著，與對照組比較(P<0.05)，說明針?biāo)幗M降低血清中HDL-C含量的效果最佳。

針?biāo)幗M、對照組與模型組相比，LDL-C含量均降低趨勢;對照組LDL-C含量未能達(dá)到正常水平。而針?biāo)幗M效果顯著，與對照組比較(P<0.05)，說明針?biāo)幗M與對照組比較針?biāo)幗M降低血清中LDL-C含量的效果最佳。

2.2 Hes5 mRNA結(jié)果

Hes5 mRNA提示血脂代謝產(chǎn)生血管內(nèi)皮破壞抑制因子，Hes5 mRNA相對表達(dá)結(jié)果升高提示血管保護(hù)修復(fù)機制增強，結(jié)果可見針?biāo)幗M、對照組與模型組相比Hes5 mRNA相對表達(dá)結(jié)果均為升高趨勢(P<0.01);并且時間越延長Hes5 mRNA相對表達(dá)結(jié)果升高趨勢越明顯。針?biāo)幗M和對照組比較針?biāo)幗MHes5 mRNA相對表達(dá)結(jié)果的效果最佳，并且連續(xù)28天效果最佳。因此得出結(jié)論針?biāo)幗M在治療28天時對血管保護(hù)修復(fù)機制活性最強。見表2～3、圖2。

表2 Hes5和β-Actin引物設(shè)計

2.3 Mash1 mRNA結(jié)果

Mash1 mRNA提示血脂代謝產(chǎn)生血管內(nèi)皮破壞因子，所以Mash1 mRNA相對表達(dá)結(jié)果減低提示血管保護(hù)修復(fù)機制增強，針?biāo)幗M、對照組與模型組相比Mash1 mRNA相對表達(dá)結(jié)果均為減低趨勢(P<0.01);并且時間越延長Mash1 mRNA相對表達(dá)結(jié)果均表現(xiàn)減低趨勢越明顯。針?biāo)幗M和對照組比較針?biāo)幗MMash1 mRNA相對表達(dá)結(jié)果的效果最佳，并且連續(xù)28天效果最佳。因此得出結(jié)論針?biāo)幗M在治療28天時對血管保護(hù)修復(fù)機制活性最強。見表4～5、圖3。

圖2 Hes5 mRNA普通PCR電泳圖

表3 Hes5 mRNA相對表達(dá)結(jié)果

表4 Mash1和β-Actin引物設(shè)計

表5 Mash1 mRNA相對表達(dá)結(jié)果

圖3 Mash1 mRNA普通PCR電泳圖

2.4 調(diào)脂飲急性毒理試驗結(jié)果

因調(diào)脂飲預(yù)試驗未能檢測LD5Q，因此僅完成最大給藥量實驗。按照最大可灌濃度及最大灌胃容量給藥[5-7]，未見實驗動物異常及死亡，實驗驗證調(diào)脂飲對于小鼠的最大耐受量≥150 g/kg， 此劑量臨床成人標(biāo)準(zhǔn)量的454倍以上。依據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為該受試藥物對受試動物無急性毒性。

3 討論

高脂血癥中醫(yī)并沒有明確病名，可將其歸屬為中醫(yī)的“痰飲”“瘀血”等范疇[8]。研究表明，針灸、中藥治療高脂血癥均有良好的效果，并認(rèn)為痰濁貫穿該病的始終，一方面痰飲是高脂血癥的病理產(chǎn)物，另一方面痰飲又是導(dǎo)致高脂血癥的病理因素[9-10]。痰飲的形成與人體的津液代謝相關(guān)，涉及到脾、腎、肝等臟腑，其中以脾臟功能失常為主，脾失健運則影響水谷精微與水液運化、輸布，使水谷津液不能轉(zhuǎn)化為人體所需要的氣血津液，這些物質(zhì)聚而成痰濁，危害人體健康，與《景岳全書》中所記載的“痰涎本皆氣血，水谷津液化得其正則為津血，化失其正，則為痰濁”不謀而合。瘀血也是高脂血癥的另一重要因素，與痰飲成為高血脂的兩大病理因素[11]。高脂血癥其中醫(yī)病機為本虛標(biāo)實，本虛以脾、腎虛為主，標(biāo)實以瘀血、痰濕為主。因此本次選擇針刺、中藥自擬方以健脾化痰、活血化瘀、補益脾腎為基本治則。

上個世紀(jì)90年代，就有研究表明針灸可以通過刺激交感神經(jīng)來促進(jìn)激素的分泌，例如腎上腺素等，使細(xì)胞膜上腺苷酸環(huán)化酶激活，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷，以促進(jìn)脂肪分解，達(dá)到降脂的目的[12]。豐隆為胃經(jīng)之絡(luò)穴,通脾胃兩經(jīng)，針刺此穴可調(diào)節(jié)脾胃臟腑功能，促進(jìn)水谷精微與津液的正常運化與輸布，同時該穴為治痰飲之要穴，《玉龍歌》中就有關(guān)于豐隆穴治療痰飲的記載,書中曰:“痰多宜向豐隆尋”。 足三里為胃經(jīng)之合穴，同時又為人體保健之要穴，臨床應(yīng)用廣泛，具有健脾和胃、化痰通絡(luò)之功。國內(nèi)學(xué)者認(rèn)為[13]“血瘀致病，三里療之”，通過對足三里穴位的針刺，可補中升陽，陽升則氣行，氣行以促進(jìn)人體血液的運行，血行則瘀血自消。動物實驗證明[14]，通過對高脂血癥新西蘭兔給予足三里穴、豐隆穴電針針刺，可以降低血清總膽固醇水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂。中脘穴位于任脈之上，既為胃經(jīng)之募穴，又為腑會，因此可治一切腑病，尤擅胃腑之疾患，脾俞為脾經(jīng)之俞穴，益脾胃、養(yǎng)氣血、化濕濁；脾俞處于脾臟氣血注輸之地，可主脾病，具有健脾除濕、益氣通血之功。中脘與脾俞相互為用，為俞募配穴，兩者能更好的健脾和胃除濕、補益氣血。國內(nèi)研究表明[15]，對俞募穴進(jìn)行穴位埋線可降低高血脂患者的血脂水平。中藥選擇山楂、丹參、虎杖、荷葉以活血化瘀；以何首烏、枸杞補肝腎；以菊花、蟬蛻以清肝，肝清則舒，可促進(jìn)瘀血的消散與痰飲的驅(qū)逐；甘草補脾兼調(diào)和諸藥，諸藥與針灸合用共達(dá)補虛化痰、活血祛瘀之功效。

查閱大量參考文獻(xiàn)高脂飼料飼喂造模，成功率很高，同時與人發(fā)病機制相似[16-18]。SD大鼠作為模型動物，能保證實驗的可操作性;血脂四項(TC、TG、LDL-C、HDL-C)是檢測血脂水平的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[19],能保證實驗的準(zhǔn)確性；而單存給藥是協(xié)定處方藥，能保證實驗陽性對照組的可靠參考性[20-21]。實驗顯示各治療均能降低TC、TG和LDL-C水平，增高HDL-C水平，微針與高劑量治療作用效果最佳。目前利用針?biāo)幏ㄖ委煾咧Y的臨床及試驗研究相對較少，因此本次研究在未來針對高脂血癥的治療上有重要的意義。在實驗過程中遇到了諸多問題，方劑研究涉及的是一個典型的多因素多水平問題，筆者對藥物組合治療方案進(jìn)行優(yōu)選，篩選對比研究，其作用已經(jīng)十分清晰，所以本研究有設(shè)立調(diào)脂飲為對照組重復(fù)驗證其作用，既具有臨床觀察證實，又存在現(xiàn)代藥理研究證據(jù)，實驗觀察此方法還可以調(diào)節(jié)谷氨酸、天門冬氨酸及GA含量的異常升高，起到腦保護(hù)的作用。然而中藥方劑受各種因素影響，比如方劑中各種藥物的配伍劑量、君臣佐使的配伍方法均存在著非常復(fù)雜的交互作用，方劑給藥途徑有口服灌腸等，各種給藥方法也會對藥物的吸收存在影響，中醫(yī)時令服藥的給藥時間，理論上也會影響藥物的治療效果，綜上這些作用影響存在協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)[22-24]。此次試驗為了驗證臨床觀察結(jié)果，筆者只是在宏觀評分及微觀分子RNA水平進(jìn)行了量化比較，仍然沒有足夠基礎(chǔ)進(jìn)行定量配伍劑量及君臣佐使的配伍方法分析，沒有足夠基礎(chǔ)對藥物間交互作用的性質(zhì)(協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng))進(jìn)行分析，未對中藥組合之間的作用機制進(jìn)行深入探討。只是依據(jù)臨床經(jīng)驗在臨床常用劑量基礎(chǔ)上調(diào)整，所以本研究只是為了改善高脂血癥的臨床療效，采用的一次初步研究，在今后的系列研究中，筆者將對本次未完成的內(nèi)容進(jìn)行更深一步的研究，期待得出更加系統(tǒng)的各種基本數(shù)據(jù)和信息，為在臨床的使用貢獻(xiàn)一份力量。