胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中B-MYB和APOBEC3B的表達及臨床意義*

馮昌銀 鄭巧靈 黃建平 蔣逸婷 楊映紅

胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastrointestinal tractpancreas neuroendocrine neoplasm，GEP-NEN） 是一組形態(tài)學和生物學呈異質性的腫瘤。以往認為其發(fā)病率較低，屬于少見病例。近年來隨著2010版WHO頒布和國內(nèi)專家共識的發(fā)布，對胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的認識不斷提高，發(fā)現(xiàn)其并不是少見病例。目前認為神經(jīng)內(nèi)分泌瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌癌具有不同的發(fā)病機制，但具體機制尚未完全闡明[1]。載 脂 蛋 白 B mRNA 編 輯 酶 3B（Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3B，APOBEC3B）能夠細胞基因組發(fā)生堿基突變，從而誘發(fā)腫瘤[2-3]。近年來發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中表達升高，而B-MYB蛋白可以參與APOBEC3B基因的激活[4-5]。目前關于B-MYB、APOBEC3B和胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的作用尚無文獻報道。本文采用免疫組化的方法觀察了B-MYB和APOBEC3B在GEPNEN腫瘤組織和瘤旁組織中的表達，并探討其與臨床病理學特征的關系，以期為闡明神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)病機制提供新的思路?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月-2017年12月福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院收治的臨床資料完整的、診斷明確的胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病例，選取其中行內(nèi)鏡微創(chuàng)切除（ESD切除）或根治性切除的標本病例126例。神經(jīng)內(nèi)分泌瘤（NET）67例，其中胃7例，腸29例，胰腺31例；神經(jīng)內(nèi)分泌癌（NEC）59例，胃34例，腸20例，胰腺5例。男81例，女45例，年齡21～79歲。所有病例均根據(jù)WHO胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標準，由兩名醫(yī)師重新閱片診斷。排除同時合并其他腫瘤的病例，所有病例手術前均未行放化療。本研究經(jīng)福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組化 所有標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，切片4 μm厚。經(jīng)脫蠟、梯度酒精至水后，經(jīng)高溫高壓抗原修復，然后按照試劑說明書行染色。免疫組化試劑B-MYB（ab76009）購自Abcam公司，按 照 1∶300稀 釋。APOBEC3B（ab191695） 購 自Abcam公司，按照1∶300稀釋。PBS代替一抗為空白對照，DAB顯示，蘇木素復染。

1.3 結果判讀 B-MYB和APOBEC3B蛋白均為細胞核著色，按照染色強度和陽性范圍進行綜合評分。染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。陽性范圍評分：計數(shù)整張切片中的腫瘤細胞，陽性細胞數(shù)0～1%計為0分，2%～5%為1分，6%～50%為2分，＞50%計為3分。切片中腫瘤細胞染色強度評分乘以染色范圍評分為該切片評分。APOBEC3B評分0分為-，1～4分為+，5～9分為 ++；0～4分為低表達組，5～9分為高表達組。由于本研究中B-MYB染色與APOBEC3B比整體偏弱，因此采用不同的分組標準，B-MYB評分0分為 -，1～2分為 +，3～9分為 ++；0～2分為低表達，3～9分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用構成比描述，組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，采用Logistic多因素分析多個變量。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 B-MYB在胃腸胰胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達B-MYB在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞的細胞核表達，在不同的病例其陽性范圍不同。在腫瘤旁組織散在的內(nèi)分泌細胞中未見表達。不同性別組的表達，男性患者B-MYB的低表達率為27.1%，高表達率為78.4%；女性患者中，B-MYB的低表達率為31.1%，高表達率為68.9%。不同年齡分組的表達，年齡＜60歲組，B-MYB的低表達率為24.4%，高表達率為75.6%；年齡≥60歲組，B-MYB的低表達率為30.6%，高表達率為69.4%。不同解剖部位的表達，胃腫瘤B-MYB的低表達率為24.4%，高表達率為75.6%；腸道B-MYB的低表達率為42.9%，高表達率為57.1%；胰腺B-MYB的低表達率為13.9%，高表達率為88.6%。不同級別腫瘤中的表達，NET中B-MYB的低表達率為22.4%，高表達率為77.6%；NEC中B-MYB的低表達率為35.6%，高表達率為64.4%。

單因素分析顯示，不同的年齡、腫瘤部位和腫瘤分類中，B-MYB表達量不同。B-MYB在年齡≤60歲組高表達率（75.6%）高于其在年齡＞60歲組（69.4%）；胰腺腫瘤B-MYB的高表達率（88.6%）最高，其次為胃腫瘤（75.6%），腸道最低（57.1%）；NET中的B-MYB的高表達率（77.6%）高于NEC（64.4%）。多因素分析顯示，NET中的B-MYB的表達高于NEC。見圖1～2和表1～2。

圖1 胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中B-MYB呈陽性，定位于細胞核，EnVision兩步法

圖2 胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中B-MYB呈陰性，EnVision兩步法

2.2 APOBEC3B在胃腸胰胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達 APOBEC3B為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞的細胞核表達，在不同的病例其陽性范圍不同。在腫瘤旁組織散在的內(nèi)分泌細胞中個別病例表達。不同性別組的表達，男性患者APOBEC3B的低表達率為35.8%，高表達率為64.2%；女性患者中，APOBEC3B的低表達率為28.9%，高表達率為71.1%。不同年齡分組的表達，年齡＜60歲組，APOBEC3B的低表達率為17.1%，高表達率為82.9%；年齡≥60歲組，APOBEC3B的低表達率為41.2%，高表達率為58.8%。不同的解剖部位的表達，胃腫瘤APOBEC3B的低表達率為46.3%，高表達率為53.7%；腸道APOBEC3B的低表達率為42.9%，高表達率為57.1%；胰腺APOBEC3B的低表達率為5.5%，高表達率為94.5%。不同級別腫瘤中的表達，NET中APOBEC3B的低表達率為8.9%，高表達率為91.9%；NEC中APOBEC3B的低表達率為61.1%，高表達率為38.9%。

單因素分析顯示，不同的年齡、腫瘤部位和腫瘤分類中，APOBEC3B表達量不同。APOBEC3B在年齡≤60歲組高表達率（82.9%）高于其在年齡＞60歲組（58.8%）；胰腺腫瘤B-MYB的高表達率（94.5%）最高，其次為腸腫瘤（57.1%），腸道最低（53.7%）；NET中的APOBEC3B的表達高于NEC。多因素分析顯示，NET中的APOBEC3B的表達高于NEC。見圖 3～4 和表 1～3。

圖3 胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中APOBEC3B呈陽性，定位于細胞核，EnVision兩步法

圖4 胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中APOBEC3B呈陰性，EnVision兩步法

表1 B-MYB、APOBEC3B的表達與胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤臨床病理特征的關系 例（%）

表2 B-MYB表達相關的多因素分析

表3 APOBEC3B表達相關的多因素分析

2.3 B-MYB與APOBEC3B表達的相關性分析 在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，B-MYB與APOBEC3B表達呈正相關（r=0.465，P=0.000），見表4。

表4 胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中APOBEC3B與B-MYB表達的相關性例

3 討論

APOBEC3家族具有7個等位基因，位于22號染色體[6]。所有的成員均具有一個保守的氨基酸序列H-X-E-X23-28-P-CX2-4-C（X為任意氨基酸）組成的鋅指結構功能域，APOBEC3B具有兩個功能結構域，可以引發(fā)單鏈DNA中含有5’-TC 模序堿基 C → T的突變[7-8]。APOBEC3B最早發(fā)現(xiàn)具有抗HIV感染和抵抗LINE-1轉座的作用[9-12]。隨后發(fā)現(xiàn)APOBEC3B在多個腫瘤細胞中表達上調(diào)，特別是在乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、宮頸癌中，可以引發(fā)細胞基因組堿基突變[2，13]。APOBEC3B預測低級別腎細胞癌患者的復發(fā)[14]。APOBEC3B在卵巢漿液性癌和食管鱗癌中表達亦升高，還可以促進腫瘤進展、轉移和治療耐藥[15-18]。

APOBEC3B在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達未見文獻報道。本組實驗收集了126例GEP-NEN，所有病例均按照WHO 2010版分類診斷。鑒于神經(jīng)內(nèi)分泌瘤G1和G2具有相同的形態(tài)和發(fā)病機制，本組實驗中將兩者歸為一組病例，即NET病例。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)APOBEC3B在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中呈高表達。單因素分析表明，APOBEC3B與患者年齡、腫瘤部位、腫瘤分類均相關。多因素分析顯示僅腫瘤分類與APOBEC3B表達相關，這由于本組實驗中病例分布不均勻，NET病例胰腺、腸道多，NEC病例胃多。本組實驗中，APOBEC3B在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中呈高表達，表明APOBEC3B可能參與腫瘤的發(fā)病，而其在NET中的表達高于NEC中的表達，這也說明NET和NE可能具有不同發(fā)病機制。

在HPV相關的腫瘤中，E6蛋白可以促進p53蛋白降解而引起p53蛋白功能受到抑制，從而引發(fā)APOBEC3B蛋白表達升高[19-21]。在非HPV病毒相關的多種腫瘤中，B-MYB蛋白與APOBEC3B基因啟動結合，引起轉錄[3]。為了驗證胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中APOBEC3B表達是否與B-MYB相關。本研究檢測了B-MYB蛋白與APOBEC3B蛋白表達的相關性，發(fā)現(xiàn)APOBEC3B蛋白與B-MYB蛋白表達存在一定的正相關（r=0.465，P=0.000）。因此在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，B-MYB蛋白可能誘發(fā)APOBEC3B蛋白表達，從而促進內(nèi)分泌細胞惡變。但是最近的文獻研究顯示，通過高通量測序胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤基因組，發(fā)現(xiàn)13例胰腺NET中僅2例發(fā)現(xiàn)具有APOBEC3B引起的堿基突變[22-24]。本組實驗中，B-MYB蛋白表達與APOBEC3B蛋白僅存在弱的相關性，兩者在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的關系有待于進一步證實。胃和腸的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤APOBEC3B蛋白是否引發(fā)堿基突變還未知，APOBEC3B在NET中的表達及其意義還需更多的病例進一步研究。