n-3多不飽和脂肪酸抑制骨骼肌蛋白異常分解的研究進(jìn)展

高頤雄 趙 勤 譚 信* 張 堅*

（1 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所 北京100050 2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院 北京100081）

骨骼肌萎縮主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量的下降以及骨骼肌力量和功能的減退，它既能增加罹患者跌倒以及跌倒后發(fā)生骨折的概率，又能增加慢性非傳染性疾病患者的死亡率[1]。既往臨床上骨骼肌萎縮常見于慢性非傳染性疾病所致的機(jī)體代謝紊亂，如肥胖綜合征，以及糖尿病、慢性腎臟疾病與癌癥惡病質(zhì)等所致的體重下降[2]。近年來，隨我國進(jìn)入老齡化社會，與年齡增長相關(guān)的肌肉衰減綜合征（sarcopenia）也日益受到關(guān)注[3]。導(dǎo)致骨骼肌萎縮發(fā)生的始動因素目前還不清楚，可能與遺傳因素、機(jī)體代謝狀況和慢性非傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。任何導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞蛋白分解代謝速率增加并超過合成代謝速率的非正常因素，都可能誘發(fā)骨骼肌萎縮。研究骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解的誘因及其抑制途徑，無論從改善骨骼肌萎縮罹患者的生存質(zhì)量，還是從降低社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)的角度考慮，均具有明確而迫切的實際需要。

n-3 多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）是一類具有多種生理效益的食物成分[4]，其最為熟知的種類是α 亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。EPA 和DHA 一般被稱為n-3長鏈多不飽和脂肪酸（n-3 LCPUFA），主要來源于海魚等動物性食物[5]，ALA 主要來源于菜籽油和豆油等植物性食物[6]。有研究發(fā)現(xiàn)：不同n-3 PUFA可以通過多種不同途徑刺激胰島素分泌，增加機(jī)體胰島素敏感性，并降低骨骼肌細(xì)胞內(nèi)有害因素對胰島素/Akt 信號通路活性的抑制[7]，而胰島素/Akt 信號通路的正常運作對于抑制骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解發(fā)揮重要作用[8-9]。由此可見，研究n-3 PUFA 調(diào)控骨骼肌組織胰島素/Akt 信號通路的機(jī)制，對于探究骨骼肌萎縮的發(fā)生原因與預(yù)防措施，具有重要意義。

1 胰島素/Akt 信號通路抑制骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解的機(jī)制

在正常情況下，胰島β 細(xì)胞分泌的胰島素經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)骨骼肌組織后，與骨骼肌細(xì)胞膜上的胰島素受體α 亞基結(jié)合，引起β 亞基的蛋白酪氨酸激酶活化，繼而磷酸化胰島素受體底物-1（IRS-1）的酪氨酸殘基。IRS-1 被激活后將信號傳導(dǎo)到磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K），再經(jīng)一系列下游信號傳導(dǎo)磷酸化蛋白激酶B（Akt）使之激活[10]。激活的Akt 通過抑制叉頭框蛋白O3 轉(zhuǎn)錄因子（Fox-O3 transcription factors）的活化，進(jìn)而抑制由Fox-O3 表達(dá)所介導(dǎo)的肌肉特異E3 泛素連接酶Atrogin-1/MAFbx 和自噬介質(zhì)Binp3 的表達(dá)。因為Atrogin-1/MAFbx 表達(dá)上調(diào)可激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，促進(jìn)蛋白分解，Binp3 表達(dá)上調(diào)可激活自噬溶酶體途徑促進(jìn)自噬作用，所以維持胰島素/Akt信號通路的活性被認(rèn)為可以抑制骨骼肌細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常分解[8-9]。當(dāng)胰島素分泌不足和/或有害因素導(dǎo)致的包括Akt 活性減弱在內(nèi)的胰島素抵抗發(fā)生時，均可引發(fā)一系列骨骼肌細(xì)胞內(nèi)下游信號通路的改變，啟動泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體途徑并最終導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞蛋白的異常分解[11]。胰島素分泌不足以及胰島素利用能力下降常見于糖尿病等機(jī)體代謝紊亂?？蓪?dǎo)致骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Akt 活性減弱的有害因素主要包括過量的炎性細(xì)胞因子與飽和脂肪酸（SFA）。

炎性細(xì)胞因子（如IL-6 與TNF-α）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和飽和脂肪酸的脂毒性代謝產(chǎn)物對骨骼肌細(xì)胞的胰島素/Akt 信號通路的有害影響往往互為因果，共同導(dǎo)致通路抑制[12]。SFA 的代謝產(chǎn)物，如甘油二酯和神經(jīng)酰胺等，對骨骼肌細(xì)胞的脂毒性作用的主要機(jī)理即抑制胰島素/Akt 信號通路的活性[13]。這些分子可以介導(dǎo)核因子κb（NF-κb）以及多種炎性細(xì)胞因子（如TNF-α 和IL-6）的激活與表達(dá)，繼而通過多種途徑導(dǎo)致胰島素/Akt 信號通路異常，例如：1） 活化的NF-κb 可以通過活化IKK 使IRS-1 的絲氨酸殘基磷酸化，從而抑制胰島素/Akt 信號通路上的重要信號分子PI3K 的活化，并可啟動炎性細(xì)胞因子（TNF-α 和IL-6）基因的轉(zhuǎn)錄；2） 炎性細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)同樣具有進(jìn)一步活化NF-κb 的作用，并且可以降低骨骼肌細(xì)胞IRS-1 的酪氨酸磷酸化和增加其絲氨酸磷酸化，這一磷酸化比例的改變既能導(dǎo)致IRS-1 被泛素化/蛋白酶體降解增加，又能降低IRS-1 與PI3K的p85 亞基結(jié)合的能力。炎性細(xì)胞因子TNF-α 通過骨骼肌細(xì)胞的TNF 受體1 上調(diào)蛋白磷酸酶2C的表達(dá)，繼而降低乙酰輔酶A 羧化酶磷酸化，抑制飽和脂肪酸的氧化分解，增加其在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)脂毒性代謝產(chǎn)物的蓄積，形成惡性循環(huán)[13-14]。

簡而言之，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常分解，特別是泛素-蛋白酶體與自噬溶酶體途徑的異常激活，在骨骼肌組織萎縮發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中扮演了重要的角色。胰島素/Akt 信號通路的正常運作有助于抑制上述途徑的異常激活。研究并闡明包括膳食在內(nèi)的多種可以維持胰島素/Akt 信號通路正常活性的干預(yù)手段及其機(jī)制，將有助于對抗骨骼肌萎縮的發(fā)生及其對罹患者所造成的不良影響。

2 n-3 PUFA 對胰島素分泌及胰島素敏感性提高的促進(jìn)作用

2.1 n-3 PUFA 促進(jìn)胰島素分泌的直接/間接途徑

以含有ALA（500μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠源胰島β 細(xì)胞（INS-1），結(jié)果顯示：48h 后ALA 干預(yù)組的基礎(chǔ)胰島素分泌量與葡萄糖刺激的胰島素分泌量均顯著高于棕櫚酸（PA）、油酸（OA）和亞油酸（LA）干預(yù)組（P＜0.05）。ALA 干預(yù)組的G 蛋白偶聯(lián)受體40（GPR40）的mRNA 表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.01）以及OA 和LA 干預(yù)組（P＜0.05），而OA 和LA 干預(yù)組則與對照組無顯著差異（P＞0.05）。GPR40 蛋白的表達(dá)結(jié)果與其mRNA 表達(dá)結(jié)果類似[15]。這一研究提示：ALA 促進(jìn)胰島β 細(xì)胞分泌胰島素可能是通過直接活化胰島β 細(xì)胞膜的GPR40達(dá)到的。

ALA 間接促進(jìn)胰島素分泌的途徑同樣與GPR40 有關(guān)，即：ALA 與腸內(nèi)分泌細(xì)胞胞膜的GPR40 結(jié)合后，可促進(jìn)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），進(jìn)而發(fā)揮腸促胰島素效應(yīng)[16]。EPA 與DHA 這兩種n-3 LCPUFA 則可與腸內(nèi)分泌細(xì)胞胞膜的GPR120 結(jié)合，進(jìn)而刺激GLP-1 的分泌[17]。此外，EPA 與DHA 還可通過下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）的表達(dá)改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝環(huán)境，從而間接促進(jìn)胰島素分泌[18-19]。

2.2 n-3 PUFA 對細(xì)胞胰島素敏感性的影響

ALA 提高胰島素敏感性的能力主要是通過促進(jìn)胰島素樣生長因子-1 （IGF-1） 的分泌實現(xiàn)[20]。IGF-1 對骨骼肌細(xì)胞膜IGF-1 受體 （IGF-1R）及胰島素受體均具有親合性，與這些受體結(jié)合后可發(fā)揮胰島素樣活性，繼而激活下游PI3K、Akt 等信號分子，結(jié)果表現(xiàn)為胰島素敏感性的提高[21-22]。與ALA 相比，EPA 與DHA 間接促進(jìn)胰島素敏感性的途徑更為豐富，主要包括：1）EPA 與DHA 通過維持Iκb 的活性，從而抑制NF-κb 的活化，繼而抑制NF-κb 信號通路的激活和炎性細(xì)胞因子（TNFα 和IL-6）的表達(dá)，達(dá)到提高胰島素敏感性的目的[23-24]；2）EPA 促進(jìn)IGF-1 和愛帕琳肽（apelin）的分泌[25-26]，以及DHA 促進(jìn)IL-10 的分泌[24]，均有助于骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性的增加。

3 n-3 PUFA 維持骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Akt 活性抑制蛋白異常分解的研究

Bryner 等[27]以小鼠C2C12 肌管細(xì)胞為研究對象，分別用PA（0.5 mmol/L）與DHA（0.1 mmol/L）處理，96h 后PA 處理組的肌管直徑與空白對照組相比下降90%（P＜0.001），而DHA 處理組與PA+DHA 處理組96 h 后與空白對照組相比均上升約10%（P＜0.05）。以胰島素 （100 nmol/L） 處理15 min，Western blot 檢測結(jié)果顯示，PA 處理組磷酸化Akt（p-Akt）的表達(dá)僅為空白組、PA+DHA 處理組和DHA 處理組的50%，總Akt 的表達(dá)僅為25%～45%（P＜0.02），PA+DHA 處理組和DHA 處理組與空白組相比Akt 表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異[27]。另一項同樣以C2C12 肌管細(xì)胞為研究對象的類似研究進(jìn)一步表明，以PA （500 μmol/L） 和/或DHA（100 μmol/L）處理，28h 后棕櫚酸處理組的C2C12細(xì)胞蛋白降解比空白組上升31%（P＜0.01），而PA+DHA 處理組與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；實時定量PCR（real-time qPCR）檢測結(jié)果顯示，PA處理組E3 泛素連接酶Atrogin-1/MAFbx 的mRNA（處理4h） 和自噬介質(zhì)Binp3 的mRNA （處理24h）與空白組相比均顯著上升（P＜0.01），PA+DHA處理組與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；Western blot檢測結(jié)果顯示，從開始處理后2h 起至24h，PA 處理組的Akt473 號位的絲氨酸的磷酸化持續(xù)被抑制，而PA+DHA 處理組從處理后4h 起Akt 的磷酸化恢復(fù)至空白對照組水平；與空白組相比，DHA干預(yù)（24 h）可以顯著降低自噬相關(guān)蛋白LC3B-II的表達(dá)水平（P＜0.05），這一降低與PA 是否存在無關(guān)[28]。上述研究表明飽和脂肪酸（PA）及其細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的脂毒性可以通過抑制胰島素/Akt 信號通路活性而導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解，分解的具體途徑與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體途徑的激活有關(guān)，而DHA 有助于抑制上述途徑的激活并抑制其所造成的有害效應(yīng)。

ALA（50 μmol/L）同樣可抑制C2C12 肌管細(xì)胞中PA（500 μmol/L）介導(dǎo)的甘油二酯與神經(jīng)酰胺的合成，然而該濃度ALA 無法促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞中PA 的β 氧化分解，也無法解除PA 對于Akt 活化的抑制效應(yīng)。EPA（50 μmol/L）和DHA（50 μmol/L）則具有這些能力。這提示：ALA 至少在較低濃度時可能不具有維持骨骼肌細(xì)胞Akt 活性的能力[29]。

4 對已有研究的總結(jié)與展望

雖然上述研究表明n-3 LCPUFA 具有抑制骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解的效果[27-28]，但是以下兩個問題的存在仍不容忽視：1）n-3 LCPUFA 主要存在于海魚類食物中，而增加魚類食物的消費量與我國大部分居民的傳統(tǒng)膳食模式并不相符，民眾較難接受。例如，全國營養(yǎng)狀況監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示：2012年我國居民魚蝦類食物消費量僅為平均23.7 g/（標(biāo)準(zhǔn)人·d），而且這一數(shù)據(jù)較2002年的數(shù)據(jù)平均29.6 g/（標(biāo)準(zhǔn)人·d）還有所下降[30]；2）增加海魚類食物的消費量同樣可能導(dǎo)致消費者特定種類污染物的暴露劑量上升，繼而導(dǎo)致其他方面的健康風(fēng)險增加，如甲基汞所致的胎兒/新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損害和二噁英類化合物所致一般人群的癌癥罹患風(fēng)險上升[31-32]。

既往觀點認(rèn)為ALA 等植物來源n-3 PUFA的生理效益主要是通過內(nèi)源合成途徑產(chǎn)生n-3 LCPUFA，以彌補(bǔ)其直接攝入的不足。隨著研究的不斷深入，植物來源n-3 PUFA 具有獨特的生理效益，這一觀點正成為共識。如前所述，盡管ALA在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)可能不具有維持Akt 活性的能力，但是其具有促進(jìn)胰島素分泌與增加胰島素敏感性的能力，且發(fā)揮這些能力的機(jī)制與EPA 和DHA 也不盡相同。此外，更加值得重視的一個實際情況是：我國居民植物油的消費量近年來穩(wěn)步增加，從2002年的32.9 g/（標(biāo)準(zhǔn)人·d）增至2012年的37.3 g/（標(biāo)準(zhǔn)人·d）[30]，而ALA 主要就存在于我國居民消費量較大的部分種類的植物油，比如菜籽油和豆油中[6]。上述研究與調(diào)查結(jié)果提示，對植物來源n-3 PUFA 生理效益的研究，應(yīng)該給予像n-3 LCPUFA 一樣的關(guān)注程度，這不僅與我國居民的膳食模式更加契合，也有助于降低膳食n-3 PUFA 由單一種類食物資源提供而可能導(dǎo)致的食品安全隱患。

ALA、EPA、DHA 在碳鏈長度與不飽和程度上存在遞增關(guān)系，它們在維持胰島素/Akt 信號通路及由此抑制骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解的能力上各有側(cè)重，這提示碳鏈長度與不飽和程度介乎于它們之間的其它n-3 PUFA 可能兼有它們的效能，比如十八碳四烯酸（SDA）。這種n-3 PUFA 在自然界主要發(fā)現(xiàn)于紫草科 （Boraginaceae） 藍(lán)薊屬（Echium）植物的種子中，由其提煉的食用藍(lán)薊籽油中SDA 含量可超過10%。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，商品化的富含SDA 的轉(zhuǎn)基因大豆油中SDA 的含量可達(dá)20%以上[33]。由于上述植物性食物資源的開發(fā)，SDA 于近年逐漸受到關(guān)注。目前為止，關(guān)于SDA 內(nèi)源轉(zhuǎn)化之外的生理效益的報道仍較為有限，例如有報道指出SDA 干預(yù)與CD95 介導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞凋亡間存在關(guān)聯(lián)[34]。然而，SDA 是否能通過胰島素/Akt 信號通路影響骨骼肌細(xì)胞尚未見報道?？梢灶A(yù)見，針對包括SDA 在內(nèi)的n-3 PUFA 的持續(xù)研究，將會進(jìn)一步拓展與深化人們對n-3 PUFA 作用于胰島素/Akt信號通路，繼而抑制骨骼肌細(xì)胞蛋白異常分解的認(rèn)識，并為通過膳食手段預(yù)防生理與病理性骨骼肌萎縮提供新的思路。