子宮內(nèi)膜癌組織microRNA-944的表達(dá)及臨床意義

章麗，張志秀，于愛軍，李明

（山東省德州市人民醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科，2.病理科，山東 德州 253014）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma, EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，且患者的預(yù)后較差[1]。EC早期患者，在接受根治手術(shù)治療后，其5年總存活率可高達(dá)96%[2]。然而，EC在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)后，采用內(nèi)分泌、放化療的治療效果并不理想，患者的存活率較低[3]。因此，臨床上迫切需要尋找與EC腫瘤形成相關(guān)且有助于EC早期診斷、預(yù)后預(yù)測的分子靶標(biāo)。微RNAs（microRNAs）為長度約22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解mRNA和/或抑制翻譯，負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。MicroRNAs在很多重要的生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖、凋亡、病毒感染及腫瘤發(fā)生等[4]。研究證實(shí)，在宮頸癌的腫瘤形成和惡性進(jìn)展過程中，存在多種microRNAs異常表達(dá)[5]，然而僅少數(shù)microRNAs在宮頸癌中的功能被深入研究。本研究以EC患者的癌組織樣本為研究對象，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測EC癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中microRNA-944（miR-944）的表達(dá)情況，并分析miR-944表達(dá)與EC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年6月—2015年6月山東省德州市人民醫(yī)院80例EC患者的癌組織手術(shù)標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有完整的病歷資料；②術(shù)后病理診斷為EC；③術(shù)前均未接受放化療；④無內(nèi)分泌、免疫和代謝性疾病；⑤術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未服用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②全身感染性疾??；③肝腎疾病。本研究中，＜55歲患者43例，≥55歲患者37例；絕經(jīng)前患者47例，絕經(jīng)后患者33例；子宮內(nèi)膜樣腺癌患者51例，非子宮內(nèi)膜樣腺癌患者29例；組織分級：G1患者16例，G2患者26例，G3患者38例；肌層浸潤深度≤1/2患者39例，肌層浸潤深度＞1/2患者41例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者54例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者26例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者49例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者31例；國際婦產(chǎn)聯(lián)盟（FIGO）分期：Ⅰ、Ⅱ期患者43例，Ⅲ、Ⅳ期患者37例。另收集同期30例子宮肌瘤等良性病變行子宮切除術(shù)患者的正常子宮內(nèi)膜組織作為對照組。所有子宮內(nèi)膜組織樣本離體后，立即保存于液氮中。本研究獲該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑與儀器 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，MicroRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，SYBR Green購自德國Roche公司，real-time PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司。Nanodrop分光光度計(jì)購自美國Thermo公司，qRT-PCR擴(kuò)增儀購自德國Roche公司。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-944表達(dá) 從液氮中取出組織樣本，迅速置于10 ml離心管中，加入Trizol試劑，以勻漿器高速間斷勻漿，勻漿過程中，離心管置于冰上。Trizol法提取EC癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中總RNA，操作步驟參照RNA提取試劑盒的說明書。Nanodrop分光光度計(jì)檢測總RNA濃度及純度（OD260/OD280比值在1.8～2.0），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。引物序列如下：miR-944正向5'-CGCGAGCAGGAAATTATTGTA-3'，miR-944反 向5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3'；內(nèi)參 U6正向 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6反向 5'-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3'。定量PCR擴(kuò)增儀檢測miR-944相對表達(dá)水平。qRT-PCR擴(kuò)增體系為10 μl，反應(yīng)條件：95oC預(yù)變性10 s，95oC變性15 s，60oC退火20 s，70oC 延伸 20 s，共 35 個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法表示miR-944相對表達(dá)量。每個(gè)組織樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 隨訪

隨訪方式為電話或者門診。隨訪時(shí)間為患者術(shù)后1～48個(gè)月，隨訪終點(diǎn)事件為患者死亡或者到達(dá)隨訪截止時(shí)間（2017年6月）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組的比較采用方差分析，兩組的比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，建立Kaplan-Meier生存模型，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，采用受試者操作特征（receiver operation characteristic, ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中miR-944表達(dá)情況

EC癌組織中miR-944相對表達(dá)量與正常子宮內(nèi)膜組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.405，P=0.000），EC癌組織（3.29±1.21）高于正常子宮內(nèi)膜組織（1.02±0.32）。

2.2 EC癌組織中臨床病理特征與miR-944表達(dá)的關(guān)系

EC癌組織中，miR-944表達(dá)與患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、病理分型及組織分級無關(guān)（P＞0.05）；而與腫瘤肌層浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及FIGO分期相關(guān)（P＜0.05）。在肌層浸潤深度＞1/2組的癌組織中，miR-944表達(dá)水平高于肌層浸潤深度≤1/2組（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的癌組織中，miR-944表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌組織中，miR-944表達(dá)水平高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）；在Ⅰ、Ⅱ期組的癌組織中，miR-944表達(dá)水平低于Ⅲ、Ⅳ期組（P＜0.05）。見附表。

2.3 EC癌組織中miR-944表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系

以平均值為界限，將EC患者分為miR-944低表達(dá)組（34例）與miR-944高表達(dá)組（46例），繪制Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果顯示，miR-944高表達(dá)組患者的5年總生存率與低表達(dá)組患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.534，P=0.003），高表達(dá)組為54.35%（25/46），低于miR-944低表達(dá)組患者的85.29%（29/34）。miR-944高表達(dá)組的患者平均生存時(shí)間為（50.09±2.03）個(gè)月，而miR-944低表達(dá)組患者的平均生存時(shí)間為（56.03±1.83）個(gè)月，Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-944高表達(dá)組患者的生存時(shí)間較miR-944低表達(dá)患者降低（χ2=7.784，P=0.006）。見圖1。

2.4 miR-944表達(dá)對患者預(yù)測/診斷價(jià)值分析

以正常對照組和子宮內(nèi)膜癌組為樣本，進(jìn)行miR-944表達(dá)水平的ROC分析，分析miR-944表達(dá)水平對患者是否具有一定的輔助診斷/判斷價(jià)值。約登指數(shù)=（敏感性+特異性-1），約登指數(shù)最大時(shí)對應(yīng)的miR-944相對表達(dá)量，即為鑒別診斷閾值，本研究中的鑒別診斷閾值為1.8，在此閾值點(diǎn)，敏感性為74.3%，特異性為70.8%，ROC曲線的曲線下面積（AUC）為0.784，1-特異性為29.2%，約登指數(shù)為0.451。ROC曲線見圖2。

附表 EC癌組織中臨床病理特征與miR-944表達(dá)的關(guān)系（±s）

臨床病理特征 n miR-944 t/F值 P值年齡＜55歲 43 3.36±1.22 0.522 0.603≥55歲 37 3.22±1.17絕經(jīng)狀態(tài)絕經(jīng)前 47 3.29±1.24 0.034 0.973絕經(jīng)后 33 3.30±1.36病理分型子宮內(nèi)膜樣腺癌 51 3.42±1.45 1.074 0.286非子宮內(nèi)膜樣腺癌 29 3.07±1.31組織分級G1 16 3.25±1.17 0.641 0.529 G2 26 3.09±1.34 G3 38 3.45±1.24肌層浸潤深度≤1/2 39 2.51±1.37 4.567 0.000＞1/2 41 4.04±1.61淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有54 3.48±1.24 2.100 0.039無26 2.83±1.41遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有49 3.53±1.46 2.192 0.031無31 2.82±1.33 FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期 43 3.02±1.35-3.069 0.001Ⅲ、Ⅳ期 37 3.71±1.49

圖1 EC癌組織中miR-944表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系

圖2 ROC曲線

3 討論

EC發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第6位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全球EC新發(fā)病例數(shù)約32萬[6]。EC是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，且多種危險(xiǎn)因素可誘發(fā)EC，如高血壓、絕經(jīng)狀態(tài)、不孕癥及家族史等[7]。近年來，對EC診斷和治療方面取得了巨大進(jìn)展，然而EC晚期患者的預(yù)后并不樂觀，其5年總生存率僅10%～29%[8]。在人類腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展中，存在多種microRNAs的功能異常和表達(dá)異常。MicroRNAs可同時(shí)具有促癌基因和抑癌基因功能[9]，取決于其下游靶基因的功能，如miR-340在骨肉瘤癌細(xì)胞通過靶向沉默ROCK1基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，具有抑癌基因功能[10]，而在胃癌細(xì)胞中，miR-340則能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮促癌基因的功能[11]。多種microRNAs在EC細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮促癌基因或者抑癌基因的功能，如miR-199A-3P[12]、miR-101[13]等。越來越多的證據(jù)表明，miR-944參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展過程，本研究關(guān)注miR-944在EC癌組織中表達(dá)情況及其臨床意義。

首先，qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，miR-944在EC癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，提示在EC腫瘤形成過程中，miR-944可能發(fā)揮促癌基因的功能，同時(shí)也有研究證實(shí)，miR-944在非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer, NSCLC）中靶向下調(diào)抑癌基因SOCS4表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤形成，發(fā)揮促癌基因功能[14]，然而，miR-944在胃癌[15]、食道癌[16]及結(jié)腸癌[17]等腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因功能，可能與腫瘤所屬組織器官差異或者miR-944下游靶基因不同有關(guān)。

分析EC癌組織中miR-944表達(dá)與EC患者臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-944在肌層浸潤深度＞1/2、存在淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅲ、Ⅳ期的癌組織中的表達(dá)水平較高，提示在miR-944可能促進(jìn)了EC癌細(xì)胞對周圍組織浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且miR-944具有作為EC早期診斷（Ⅰ、Ⅱ期）指標(biāo)的潛能。miR-944可能是通過靶向調(diào)節(jié)與腫瘤浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮作用，如XIE等[18]研究證實(shí)，miR-944靶向下調(diào)抑癌基因S100PBP表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲遷移，本研究并未對miR-944促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行探究，將在以后的研究中進(jìn)行探索。

此外，本研究對miR-944表達(dá)與EC患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，miR-944高表達(dá)的EC患者，其術(shù)后5年總生存率和平均生存時(shí)間均低于miR-944低表達(dá)患者，提示miR-944高表達(dá)可能預(yù)示著較低的生存率和較短的生存時(shí)間，與EC患者不良預(yù)后密切相關(guān)，miR-944具有作為EC患者不良預(yù)后預(yù)測的生物靶分子的潛能。HE等[19]在乳腺癌中的研究結(jié)果也得到類似的結(jié)論，miR-944通過靶向調(diào)節(jié)BNIP3基因表達(dá)，產(chǎn)生獲得性耐藥，miR-944可作為乳腺癌患者不良預(yù)后的預(yù)測靶標(biāo)。

最后，miR-944表達(dá)水平的ROC分析，結(jié)果提示：當(dāng)miR-944表達(dá)水平在1.8（ROC分析所得閾值）以上時(shí)，患者EC的陽性率提高。提示其可作為判斷EC的輔助證據(jù)，ROC曲線下面積AUC值較高（0.784），敏感性和特異性也較好。董動(dòng)麗等[20]的研究結(jié)果表明，血清HE4和CA125診斷EC的敏感性分別為54.67%和28.00%，特異性分別為98.57%和91.43%，與之相比，本研究中miR-944診斷EC的敏感性較高，而特異性偏低。當(dāng)然，由于本研究的實(shí)驗(yàn)樣本量較少，可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定的偏倚，在后續(xù)的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，以得到更加可靠、準(zhǔn)確的結(jié)論。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)，miR-944在EC癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，且miR-944高表達(dá)預(yù)示著患者可能發(fā)生肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且與患者較低的術(shù)后5年總生存率和較短平均生存時(shí)間相關(guān)，提示miR-944參與并促進(jìn)了EC腫瘤形成和惡性進(jìn)展，miR-944可作為EC早期診斷和預(yù)后預(yù)測的潛在靶點(diǎn)。