蓬亂蛋白2干擾和過表達慢病毒載體的構建及其在hUVECs中的表達*

生欣，王俊華，劉月華，郜雙林，謝夏丹，范芳

（遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563000）

蓬亂蛋白（Dishevelled, DVL）是一類穿梭于胞質(zhì)和細胞核的Wnt信號通路蛋白，能夠與多種蛋白相互作用，將Wnt信號由膜受體Frizzled傳遞至下游組件[1]。DVL最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體毛和翅毛異常定位表型中，在進化上高度保守[2]。目前在人類中已知的DVL有3個亞型（DVL1，DVL2和DVL3），均具有3個高度保守的結構域，即N-端的DIX結構域、內(nèi)部的PDZ結構域和C-端的DEP結構域[3-4]。該蛋白不僅參與細胞的增殖、遷移和凋亡，而且與胚胎發(fā)育、細胞極性、分化及腫瘤發(fā)生等過程相關[5-6]。盡管通過結構域特征能夠預測其功能，但是該蛋白在不同組織和細胞中確切的生物學功能還不清楚[7]。

近年來，大量研究顯示W(wǎng)nt信號通路參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[8-9]。Wnt5α能夠通過經(jīng)典Wnt信號通路引發(fā)內(nèi)皮細胞炎癥反應[10-11]，且該通路過度激活能夠?qū)е缕交〖毎鲋澈脱軆?nèi)膜增厚[12-13]，但有關DVL在該過程中的作用還未見報道。本課題組在動脈粥樣硬化的體內(nèi)外模型中觀察到DVL2的異常表達，然而，其具體的作用機制還不清楚。相比常規(guī)的逆轉錄病毒和腺病毒表達系統(tǒng)，慢病毒表達系統(tǒng)能夠?qū)⒉《净蚪M整合到宿主基因組，從而實現(xiàn)長時間穩(wěn)定表達，且具有能夠感染非分裂期細胞、產(chǎn)生免疫反應小、可插入大片段外源基因等優(yōu)點，成為導入外源基因的有利工具，并被廣泛應用于各種細胞系、原代細胞和干細胞的基因過表達、RNA干擾、microRNA研究，以及基因缺陷型動物模型復制等研究中[14]。因此，本研究擬構建DVL2的慢病毒干擾和過表達載體，建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）的穩(wěn)定表達株，并在體外研究其對DVL2基因表達的影響，以期為進一步探索DVL2在動脈粥樣硬化發(fā)生早期的作用及其蛋白互作關系奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的慢病毒系統(tǒng)pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-puro、pHB-U6-CMV-MCS-PGKZsGreen-puro、感受態(tài)DH5α細胞均由遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學教研室保存，hUVECs、HEK 293T細胞株和含有生長因子的內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），pSPAX2、pMD2G（美國Addgene公司），轉染試劑Lipofectamine 2000、DMSO、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4連接酶、質(zhì)粒提取與純化試劑盒PureLinkTMHiPure Plasmid Maxiprep Kit、DNA Polymerease、DNA ladder、 蛋 白Marker（美國Thermo Fisher Scientific公司），載體回收試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（日本TaKaRa公司），凝膠回收試劑盒、BCA定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司），PCR引物、瓊脂糖、瓊脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因h-DVL2CDS區(qū)域的擴增 提取hUVECs細胞基因組DNA，設計正向引物h-DVL2-Eco/Eco-F（5'-GGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATG GCGGGTAGCAGCACTG-3'）和反向引物h-DVL2-Eco/Eco-R（5'-TCTAGAACTAGTCTCGAGCATAACATCCA CAAAGAACTCGCT-3'）。以基因組DNA為模板擴增合成目的基因h-DVL2的CDS區(qū)域，反應條件為：95℃預變性 5 min，94℃變性20 s，55℃退火 20 s，72℃ 延伸150 s，共27個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min；PCR產(chǎn)物電泳回收純化，測序分析。

1.2.2 干擾靶點設計和引物合成 以人DVL2基因的mRNA序列（GeneBank Accession No.NM_004422.2）根據(jù)shRNA設計原則設計shRNA靶序列和對照病毒載體（見表1、2）。合成引物，分別稀釋至100 μmol，引物退火（95℃ 10 min，75℃ 10 min，55℃ 10 min，35℃ 10 min，15℃ 10 min）形成帶黏性末端的雙鏈片段，退火處理后得到shRNA模板用于連接反應。

1.2.3 過表達和干擾表達載體的構建 分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切目的基因和慢病毒載體，將目的基因與線性化慢病毒過表達載體pHBLVCMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-puro連接，插入MCS區(qū)，獲得重組過表達質(zhì)粒pHBLV-HDVL2。將shRNA模板與線性化的慢病毒干擾載體pHB-U6-CMVMCS-PGK-ZsGreen-puro連接，插入U6啟動子后，獲得重組干擾質(zhì)粒pHB-shRNA-HDVL2。分別轉化到大腸桿菌DH5α中，通過菌液PCR鑒定，將陽性克隆菌液測序分析。

1.2.4 重組表達h-DVL2慢病毒在HEK293T細胞中的包裝和轉染 采用3質(zhì)粒系統(tǒng)進行病毒包裝，包括慢病毒穿梭質(zhì)粒，即已經(jīng)制備的重組慢病毒質(zhì)粒pHBLV-HDVL2/pHB-shRNA-HDVL2，2種輔助包裝原件質(zhì)粒，即pSPAX2和pMD2G。采用高純度無內(nèi)毒素抽提3種質(zhì)粒載體，濃度達到1 μg/μl，A260/280在1.7～1.8用于病毒包裝。以Lipofectamine 2000脂質(zhì)體同時將3質(zhì)粒系統(tǒng)轉染HEK293T細胞，轉染后6 h更換含10% FBS的新鮮完全培養(yǎng)基。在48 h時，收集1次培養(yǎng)基，補入新鮮完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，在72 h收集所有培養(yǎng)基，離心去除細胞碎片，收集病毒原液于超速離心管中，4℃、22 206 r/min離心120 min，分裝病毒超離液，置入-80℃冰箱冷凍保存。

表1 靶向DVL2基因的shRNA寡核苷酸單鏈

表2 對照病毒載體siRNA寡核苷酸單鏈

1.2.5 病毒滴度測定 HEK293T細胞以1×105個/ml的密度種96孔板，100 μl/孔，每個病毒準備6孔，37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將10 μl病毒液做3倍梯度稀釋，共6個稀釋度，分別加到對應的孔中，并追加培養(yǎng)基至100 μl；48 h后，換液為100 μl含1.5 μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；24 h后，換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，活細胞工作站觀察熒光，熒光百分比在10%～30%的孔計算病毒滴度；滴度（TU/ml）=細胞數(shù)×熒光百分比×MOI×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.2.6 慢病毒感染hUVECs 以1×105個/ml的密度接種hUVECs到6孔板，細胞融合度在50%～70%更換含有聚凝胺（終濃度為6 μg/ml）的適應性培養(yǎng)基，根據(jù)病毒滴度和細胞量加入相應體積的病毒原液；感染后24 h，換無病毒的適應性培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，活細胞工作站觀察，絕大部分細胞感染病毒以后，利用嘌呤霉素抗性篩選掉未感染病毒的細胞；換嘌呤霉素濃度為8 μg/ml的適應性培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1周，直至沒有感染病毒的細胞被嘌呤霉素殺光，將嘌呤霉素濃度降低到4 μg/ml繼續(xù)培養(yǎng)1周，使細胞慢病毒感染穩(wěn)定傳代；由于感染效率高，穩(wěn)定性好，故不需要進行挑取單克隆操作，將細胞擴大培養(yǎng)后即可正常使用。將感染好的細胞分為BC組（hUVECs空白對照）、NC組（HBLV-GFP-PURO陰性對照）、干擾組（pHB-shRNA-HDVL2）及過表達組（pHBLVHDVL2）。

1.2.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測mRNA相對表達量 參照試劑盒說明書，分別以RNAiso Plus提取總RNA，以Prime ScriptTMRT Master Mix進行逆轉錄，逆轉錄條件為：37℃預反應15 min；85℃擴增5 s。引物序列見表3。參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書，進行qRT-PCR反應，反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃ 退火30 s。共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進行計算。

表3 qRT-PCR引物序列

1.2.8 Western blotting檢測蛋白的相對表達量 細胞消化裂解，提取蛋白，以BCA法進行蛋白定量，以5×蛋白Loading buffer按4∶1充分混合，100℃煮沸10 min變性蛋白。每孔按BC組、NC組、干擾組、過表達組順序各上25 μg蛋白樣品溶液。80 V恒壓電泳，200 mA電轉120 min；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST，清洗6次，每次5 min；分別以兔抗人DVL2（1∶1 000）和小鼠抗人GAPDH一抗（1∶10 000）4℃，過夜孵育，1×TBST清洗；分別以山羊抗兔和兔抗小鼠二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h，1×TBST清洗；以Chemi DocTMtouch imaging System（BIO-RAD）檢測蛋白條帶ECL化學發(fā)光顯色，以ImageLab軟件檢測蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對含量=目的條帶灰度值/對應GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，其兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。每組實驗均重復3次，每個樣本每次檢測做3個復孔。

2 結果

2.1 pHBLV-HDVL2過表達慢病毒載體鑒定結果

將轉化后的陽性克隆菌液進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見整齊均一的條帶（見圖1A～D），對照DNA Marker進一步確定陽性克隆，菌液送檢進行測序鑒定，結果顯示插入序列與構建的目的片段堿基序列完全一致（見圖1E），質(zhì)粒構建成功。

2.2 h-DVL2 shRNA慢病毒載體鑒定結果

將構建的腺病毒干擾載體pHB-shRNA-HDVL2酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（見圖2A、B），膠回收。將重組的陽性克隆進行PCR擴增，得單一產(chǎn)物，將產(chǎn)物進行測序，測序結果見圖2C。測序峰圖（見圖2D）顯示在測序結果的發(fā)夾結構中，干擾序列正確。其干擾序列峰形圖均為單峰，無突變pHB-shRNA-HDVL2構建成功。

2.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定結果

慢病毒載體轉染HEK293T細胞后，熒光百分比在10%～30%的孔計算病毒滴度（見圖3），NC組、干擾組、過表達組滴度分別為2×108、2×108和1×108TU/ml。

圖1 pHBLV-HDVL2過表達載體的構建和測序結果

圖2 pHB-shRNA-HDVL2 shRNA干擾表達載體的構建和測序結果

2.4 慢病毒感染hUVECs的感染率

慢病毒感染hUVECs后，利用puro+抗性基因，加puromycin篩選掉未感染細胞。通過Image J分析得感染率＞98%（感染率=帶熒光細胞數(shù)/細胞總數(shù)）（見圖 4）。

2.5 DVL2 mRNA和蛋白相對表達量比較

各組DVL2 mRNA相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較顯示，NC組中DVL2 mRNA相對表達量與BC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.910，P=0.129）；干擾組DVL2 mRNA相對表達量較BC組降低（t=28.369，P=0.000），沉默效率為67%；過表達組中DVL2 mRNA相對表達量增加（t=-5.641，P=0.005），過表達水平為NC組的5.6倍。

各組DVL2蛋白表達比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；BC和NC組中可見DVL2條帶較細，而過表達組較粗。進一步兩兩比較顯示，NC組中DVL2蛋白表達較BC組差異無統(tǒng)計學意義（t=0.031，P=0.977）；干擾組DVL2灰度較BC組降低（t=37.025，P=0.000），干擾效率為61%；過表達組中DVL2蛋白表達增加（t=-13.004，P=0.000），表達水平為BC組的2.7倍。見圖5和表4。

圖3 慢病毒滴度測定圖 （×100）

圖4 慢病毒感染hUVECs熒光鑒定圖 （×100）

圖5 各組DVL2 mRNA和蛋白表達比較

表4 DVL2 mRNA和蛋白表達比較（n =3，±s）

表4 DVL2 mRNA和蛋白表達比較（n =3，±s）

注：?與BC組比較，P ＜0.05

組別 DVL2 mRNA DVL2蛋白BC 組 1.000±0.000 1.000±0.000 NC 組 0.930±0.005 0.987±0.009干擾組 0.301±0.006? 0.380±0.004?過表達組 5.684±0.043? 2.726±0.023?F值 35.767 222.458 P值 0.000 0.000

3 討論

本研究首先構建DVL2過表達和干擾慢病毒表達載體pHBLV-HDVL2和pHB-shRNA-HDVL2，即穿梭質(zhì)粒，酶切和測序結果顯示質(zhì)粒構建成功。進一步采用3質(zhì)粒系統(tǒng)，將表達載體和包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2G共轉染至HEK293T細胞中，進行病毒包裝形成具有感染能力的慢病毒顆粒。由于表達載體攜帶有ZsGreen綠色熒光蛋白基因，較常規(guī)的EGFP熒光更為穩(wěn)定，通過熒光顯微鏡觀察能夠獲得病毒包裝的滴度和轉染效率。原代細胞為較難轉染的細胞，本研究通過慢病毒表達系統(tǒng)，能夠?qū)y帶DVL2的過表達和干擾shRNA序列整合到原代hUVECs基因組中，并通過puromycin篩選出穩(wěn)定表達的細胞株，獲得較高的轉染效率（＞98%）。與BC組比較，過表達組的DVL2表達增加，而干擾組的DVL2表達水平下調(diào)。可見，本研究成功獲得了DVL2的干擾和過表達慢病毒載體，并能夠在原代hUVECs細胞中穩(wěn)定表達。

Wnt信號通路是由分泌型糖蛋白Wnt激活的一系列信號通路，包括經(jīng)典的Wnt/β-caternin信號通路，非經(jīng)典的Wnt/PCP信號通路和Wnt/Ca2+信號通路[15]。Wnt信號通路與動脈粥樣硬化密切相關。在臨床報道中[16]，經(jīng)典Wnt信號通路受體低密度受體脂蛋白相關蛋白6（LRP6）基因突變患者伴隨動脈粥樣硬化的風險更高，而LDLR-/-小鼠模型已經(jīng)成為研究動脈粥樣硬化的模式動物。經(jīng)典Wnt信號通路配體Wnt 5α[17]，下游蛋白β-caternin[18]及其通路抑制劑DKK-1[19]均參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和動脈粥樣斑塊的維持。因此Wnt/LRP6/β-catenin信號通路活性的改變已經(jīng)成為動脈粥樣硬化斑塊形成的一大原因。而有報道顯示，非經(jīng)典Wnt/PCP信號通路同樣也與動脈粥樣硬化相關，其下游RoA/ROCK也參與動脈粥樣硬化早期的內(nèi)皮細胞功能損傷和后期的斑塊形成和破裂[20]。DVL作為Wnt信號通路的關鍵蛋白，同時參與多條Wnt信號通路，是一個關鍵的樞紐分子[1]。在不同的Wnt信號通路中分別與不同的蛋白相互作用調(diào)控不同細胞活動。盡管Wnt信號通路與動脈粥樣硬化的關系已經(jīng)得到廣泛的認可[21-22]，然而，有關DVL在動脈粥樣硬化過程中的作用機制還清楚，只有少量研究顯示DKK通過激活DVL1參與血管內(nèi)皮細胞遷移[23-24]，也有研究猜測DVL可能通過Wnt/PCP信號通路改變血管內(nèi)皮細胞的平面極性[25]。然而，DVL在動脈粥樣硬化過程中通過與哪一些蛋白質(zhì)結合，以及通過哪一條Wnt信號通路調(diào)控內(nèi)皮細胞功能，并進一步參與動脈粥樣硬化的發(fā)生還不清楚。此外，相比DVL1和DVL3，DVL2的功能研究還較為缺乏，因此，成功構建DVL2干擾和過表達載體對于深入研究DVL2在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用及其所涉及的Wnt通路蛋白具有重要的意義。