鱸魚病毒性神經(jīng)壞死病的診斷與防治

陳 暉，方成俊，肖 穎，徐淑菲，郭書林，黃印堯

（1. 東山海關技術中心，福建東山 363401；2. 廈門海關技術中心，福建廈門 361012）

鱸魚（Lateolabrax japonicus）是一種適溫性廣、抗病力強、生長迅速、肉質鮮美的肉質性魚類，1983年從國外引進，現(xiàn)已在我國廣東、福建、浙江等地大量養(yǎng)殖[1-3]。近年來，福建、廣東省海域當年繁殖的網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚苗，在每年的5－10月，當天氣連續(xù)晴好、悶熱、海面風小時，會出現(xiàn)吃食減少、燥動、打轉等癥狀，1～2 d后死亡。死亡常呈成倍疊加發(fā)展，并持續(xù)擴散蔓延至整個海區(qū)，死亡率高達80%～90%，損失非常慘重。養(yǎng)殖1年以上的大鱸魚也會發(fā)病，但死亡率很低。養(yǎng)殖戶不明病因，只能采取少投料的半饑餓飼養(yǎng)法，因而使鱸魚苗成活率很低，僅為10%～20%。即使存活下來的鱸魚，也需要半年時間，食量才恢復正常，因而大大增加了養(yǎng)殖成本，成為當前海區(qū)鱸魚養(yǎng)殖急待破解的難題[4]。

1 發(fā)病情況

福建省漳浦縣某海水養(yǎng)殖場海水流動較好，現(xiàn)有網(wǎng)箱約20個，主要養(yǎng)殖當年繁殖的鱸魚苗及已養(yǎng)殖1年以上的花鱸，養(yǎng)成后全部用活水運輸船運往韓國，供應韓國料理店。近年來每到夏季，該海水養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的當年繁殖的鱸魚苗就會發(fā)病，死亡率極高。2017年12月，該養(yǎng)殖場從福建省東山縣某養(yǎng)殖場購進3 cm長鱸魚苗11萬尾，分4個網(wǎng)箱飼養(yǎng)，飼喂專用配合飼料，每日早晚投料各1次。當時正值冬春季節(jié)，氣溫低，鱸魚生長很正常，至2018年4月，鱸魚苗成長至6～8 cm，大約存活10.5萬尾。隨著魚苗長大，網(wǎng)箱內(nèi)鱸魚密度加大，由于工作忙，沒有及時進行分箱飼養(yǎng)。隨著氣溫升高，至4月底，漳浦縣白天氣溫達32～33 ℃，天氣悶熱，海面上持續(xù)微風，風力小于3級。此時，網(wǎng)箱內(nèi)的鱸魚出現(xiàn)煩躁、采食量明顯減少、不正常游動、平衡失調(diào)、盤旋游動、狂游、側游、自轉等癥狀，少量魚苗開始死亡；到5月1日，鱸魚病情加重，每隔1 h每個網(wǎng)箱都會有幾百條魚苗死亡；至5月2日送診時，已有7萬條鱸魚死亡，死亡率為65%左右。

2 實驗室檢驗

2.1 剖檢

5月2日清晨，從網(wǎng)箱中撈取數(shù)十條病魚，打包充氧運抵實驗室。到實驗室后，大部分魚苗已死亡。魚體表檢查發(fā)現(xiàn)：魚新鮮度好，頭體、尾、鰓、鰭、肛門都完好；明顯的病變是魚眼特別明亮，微腫脹；部分病魚一側正常，另一側有大小相近的一個新鮮破潰面，無化膿灶和異味。剖開腹腔發(fā)現(xiàn)，肝、腎、胃腸等臟器均正常，無積液和異味（圖1）。

圖1 病魚體表臨床癥狀

2.2 寄生蟲檢查

檢查病死魚體表皮膚、鰓、腹腔和臟器，末見寄生蟲感染。

2.3 細菌學檢查

（1）無菌操作，取病魚肝臟和體表破潰處組織觸片，姬姆薩氏染色鏡檢為陰性。

（2）無菌操作，取病魚肝臟、體表破潰處組織和網(wǎng)箱內(nèi)海水，分別接種于3支營養(yǎng)肉湯（含質量濃度1%NaCl、pH7.0）試管，30 ℃培養(yǎng)36 h，發(fā)現(xiàn)接種肝臟組織管肉湯不混濁，而魚表破潰組織和海水管的肉湯變混濁。再將上述混濁的二管分別接種TCBS平板，進行單菌落檢查，發(fā)現(xiàn)長出少量形態(tài)較一致的黃色菌落，通過全自動細菌分析鑒定儀鑒定，確認是溶藻弧菌。將該菌進行鱸魚苗毒力試驗，結果為陰性。

2.4 RT-PCR檢測

2.4.1 材料 （1）選擇數(shù)尾瀕死鱸魚腦、眼等活體組織，凍存于-80 ℃冰箱備用。（2）試驗所用的磁珠法通用型RNA提取試劑盒：為賽默飛世爾科技中國有限公司產(chǎn)品。（3）一步法RT-PCR試劑盒：購自寶生物工程（大連）有限公司；所用序列，采用世界動物衛(wèi)生組織（OIE） （水生動物疾病診斷手冊》（ 第3版） 推薦的引物，引物序列為：反向引物5'-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3'，正向引物5'-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3'。（4）GeneGreen核酸染料：購自天根生化科技（北京）有限公司。

2.4.2 方法

2.4.2.1 組織樣品處理 各取病魚的腦、眼約50 mg，放在1.5 mL滅菌離心管中，用滅菌碾磨棒充分研磨搗爛，加1 mL裂解液，室溫孵育3 min；加200 μL氯仿即三氯甲烷（Chloroform），小心蓋上蓋子，劇烈震蕩15 s，室溫孵育3 min；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清400 μL至5連管的第1個孔內(nèi)。

2.4.2.2 RNA提取 采用磁珠法進行RNA提取，在5連管內(nèi)分別加入相應試劑（表1），全過程在磁珠提取純化系統(tǒng)中自動進行。

2.4.2.3 一步RT-PCR法 根據(jù)神經(jīng)壞死病毒（Nervous necrosis virus，NNV）擴增片段大小設置的RT-PCR反應液如下：PCR模板5 μL，正、反向引物各2 μL（40 μmo1），Taq酶1 μL（5 mo1/L），10×Taq酶 緩 沖 液7 μL，MgCl2（25 mmo1） 6 μL，dNTP 2 μL，M-MuLV逆轉錄酶（20 U/μL） 1 μL，RNA酶抑制劑（20 U/μL）0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。程序設定為：首先42 ℃ 30 min、95 ℃ 5min，然后95 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 5連管內(nèi)所加的相應試劑及劑量

2.4.3 PCR擴增結果判定 用TBE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖（加入濃縮的10 000×GeneGreen Nucleic Acid Dye，使其在凝膠中的終濃度為1×）進行電泳，樣品孔中加入6 μL樣品和2 μL樣品緩沖液（含0.25%溴酚藍）的混合液，并設立DNA標準Marker對照。電泳后在紫外檢測儀上觀察結果發(fā)現(xiàn)在瓊脂糖電泳的421 bp位置均出現(xiàn)明顯的NNV特異性的亮帶（圖2），表明該養(yǎng)殖場鱸魚苗暴發(fā)的是VNN，也稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜病。

圖2 瓊脂糖凝膠電腦圖譜

3 防治

根據(jù)實驗室檢測結果確診為VNN，立即采取了以下綜合防治措施：

（1）24 h值班，及時撈取上浮的病死魚，然后集中銷毀；每天清理網(wǎng)箱，去除沉渣和糞便；在網(wǎng)箱內(nèi)四周，吊掛清熱解毒的中草藥包（主要成份：板蘭根、大青葉、地錦草等）[5]。

（2）在魚飼料中加入氯苯尼考，同時用黃芪多糖拌料喂魚（按藥物使用說明書劑量），連用5 d，將原每天2次投喂改為1次，食量再減半。

上述措施的效果明顯，每天死魚數(shù)量驟減，至第5天，已沒有死魚出現(xiàn)，魚群吃食、游動正常。魚群病愈生長穩(wěn)定后，在飼料中，每周3次拌入乳酸桿菌液和黃芪多糖，每天保持1次投料。

2018年10月中旬，對養(yǎng)殖戶進行回訪獲知，自2018年5月采取稀疏養(yǎng)殖、益生菌拌料和減少飼料投放量等措施后，魚體生長正常，從8月份開始改用新鮮冷凍巴拉魚等雜魚打漿，加入乳酸桿菌液和黃芪多糖拌料喂魚（每周3次），每天上午各投料1次，魚長勢很好，體長已達15～18 cm。11月份天氣轉冷時，計劃每天投喂2次，以提高魚體生長速度。

4 討論

VNN是多種海水魚的一種急性傳染病，是我國《進境動物檢疫疫病名錄》中的二類動物檢疫對象。本病大多發(fā)生在氣溫較高季節(jié)，主要侵襲幼魚的腦、視網(wǎng)膜和脊髓系統(tǒng)的神經(jīng)細胞，直接造成細胞的損傷壞死，病魚表現(xiàn)出煩躁、狂游、自轉、側游等一系列神經(jīng)癥狀，魚體表及臟器基本正常，死亡率達80%以上[6]。而本次報道的鱸魚苗VNN，除有上述神經(jīng)癥狀外，還有部分病死魚側面出現(xiàn)大小較為一致的新鮮破潰面，而尾鰭、胸鰭和背鰭和體色卻都正常，這與由虹彩病毒引起的魚表皮膚潰瘍?。兠嬖隰~體表呈大片潰爛，肌肉裸露壞死并有出血，尾鰭、胸鰭和背鰭基部紅腫潰爛，體色變黑，鰓絲和肝臟發(fā)白）完全不同[7-9]，分析認為鱸魚體表新鮮破潰面應該是病魚發(fā)病時相互撕咬造成的。

當前，關于VNN的報道多集中于石斑魚幼苗，死亡率通常在90%以上，而鱸魚VNN報道很少。本病侵襲的對象主要是幼齡魚苗，發(fā)病急，死亡率特別高，且防治資料很少。本次鱸魚苗暴發(fā)的VNN，因采取措施得當，疫情很快得到有效控制。針對VNN防治，建議采取以下措施：（1）快速防治，憑臨床經(jīng)驗，一旦確定為病毒病，立即采取針對性防制措施，控制疫情擴散；（2）針對海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖難以隔離消毒的特點，采取每天清除積食和糞便，撈取病死魚進行集中銷毀，消滅傳染源等措施；（3）網(wǎng)箱內(nèi)吊掛清熱解毒中草藥，飼料中加入益生菌、黃芪多糖，以提高免疫力；（4）發(fā)病期間，飼料中加入氟苯尼考，避免繼發(fā)細菌感染；（5）降低養(yǎng)殖密度，適當減食。實際結果證明，上述防治措施效果很好，表現(xiàn)在疫情很快被控制，死亡率從以往的80%以上，下降到65%左右，避免了較大的經(jīng)濟損失。

5 結論

2018年5月福建省漳浦縣某海水養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的鱸魚苗出現(xiàn)煩躁、自轉、側游等運動失調(diào)癥狀，繼而大批死亡，病魚眼睛發(fā)亮、微腫，部分魚體表有新鮮的破潰傷口，經(jīng)實驗室檢查，寄生蟲和細菌均為陰性。采集病魚腦、眼組織，應用RT-PCR檢測，擴增出NNV特異性的421 bp基因片段，說明該病為VNN。采取及時撈取病死魚，去除網(wǎng)箱沉渣糞便，中草藥吊袋消毒，減食和氯苯尼考、黃芪多糖、益生菌拌料等防治措施，疫情得到有效控制。該防治經(jīng)驗為VNN防控提供了技術參考。