豬瘟病例的綜合診斷及感染毒株遺傳進(jìn)化分析

王宏宇，李 超，孟凡亮，劉照虎，馬梓承，焦秋林，李 焱，曹 龍，肖一紅，劉思當(dāng)

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000；2. 山東省夏津縣畜牧獸醫(yī)局，山東夏津 253200）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高度接觸性熱性傳染病。急性病例以高熱、神經(jīng)癥狀、全身性出血為主要特征，并引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等癥狀，慢性病例因繼發(fā)或并發(fā)細(xì)菌或其他病毒感染使癥狀復(fù)雜化。該病是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病，每年給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[1]，被我國(guó)列為一類動(dòng)物疫病。CSFV只有1個(gè)血清型，3個(gè)基因型。根據(jù)CSFV E2基因序列的差異性，將CSFV分為1型（1.1、1.2、1.3和1.4亞型），2型（2.1、2.2和2.3亞型）和3型（3.1、3.2、3.3和3.4亞型）3個(gè)基因型，其中2.1亞型又分為2.1a、2.1b、2.1c和2.1d[2]。

E2蛋白又稱gP55，是目前CSF研究中較為清楚的一種結(jié)構(gòu)蛋白，由ORF編碼的370個(gè)（690～1 060）氨基酸構(gòu)成。E2蛋白是CSFV主要的保護(hù)性抗原蛋白和免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[3]，可以作為CSFV基因工程疫苗的主要靶蛋白。Risatti等[4]通過(guò)基因替換構(gòu)建嵌合病毒，證明了E2蛋白與CSFV毒力存在著密切關(guān)系，從而為CSFV毒力研究提供了新思路。

現(xiàn)今，在以疫苗免疫接種為主要防控手段下，我國(guó)CSF疫情在一定程度上得到了控制，但因種種原因，近年來(lái)仍有發(fā)生。2018年1—6月，本實(shí)驗(yàn)室先后確診了37起典型的CSF疫情，發(fā)病豬死亡率高，癥狀、病變典型，給發(fā)病豬場(chǎng)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2018年5月，山東省菏澤市某育肥豬場(chǎng)發(fā)生疑似CSF疫情。為進(jìn)一步探究CSFV的發(fā)展進(jìn)化，對(duì)該育肥豬場(chǎng)死亡病例進(jìn)行了綜合診斷，并將分離毒株進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2018年5月，山東省菏澤市某育肥豬場(chǎng)新進(jìn)仔豬突然出現(xiàn)急性發(fā)病死亡，60多頭豬死亡，死亡率超過(guò)30%。剖檢病死豬，采集脾臟、腎臟、扁桃體、淋巴結(jié)和回盲瓣等組織樣品，其中一份用10%的福爾馬林溶液固定，常規(guī)制作石蠟切片，另一份冰凍保存進(jìn)行病毒分離。

1.2 主要試驗(yàn)材料

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DMEM/HIGH GLUCOSE：購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BI胎牛血清：購(gòu)自上海逍鵬生物科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、T1載體及T1感受態(tài)細(xì)胞：均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液等：購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PK15細(xì)胞：由本實(shí)驗(yàn)室凍存；One Step RT-PCR試劑盒：購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中登錄的CSFV全基因序列，使用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，用于擴(kuò)增E2部分基因（鑒別引物）及全基因（全長(zhǎng)引物）序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 CSFV E2基因引物序列

1.4 病毒分離

將采集的組織樣品研磨后置于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后備用；用DMEM培養(yǎng)液加10%的胎牛血清用于PK15細(xì)胞培養(yǎng)，2%的胎牛血清用于病毒感染后的維持液。6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)到長(zhǎng)滿單層時(shí)，加入上清液，37 ℃感作1～2 h，用PBS洗滌，加入2 mL維持液，37 ℃培養(yǎng)2 d，連續(xù)培養(yǎng)3～4代，收集病毒液。

1.5 病毒鑒定

參照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書，對(duì)收集的病毒液進(jìn)行核酸提取。以提取的核酸為模板，用E2鑒別引物進(jìn)行PCR方法擴(kuò)增。擴(kuò)增體系按照One Step RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 E2基因序列測(cè)定

將上述核酸提取物用E2全長(zhǎng)引物進(jìn)行50 μL體系擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將目的條帶所在的凝膠部分分離，使用膠回收試劑盒回收目的片段，將膠回收的目的片段連接T1載體并轉(zhuǎn)入T1感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行增菌培養(yǎng)。將鑒定為CSFV E2的陽(yáng)性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，然后對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分子特征和遺傳進(jìn)化特點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查及剖檢病變

病死豬體溫升高，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，全身皮膚斑點(diǎn)狀出血（圖1-A）；腎臟表面點(diǎn)狀出血（圖1-B），腦膜充血出血（圖1-C），脾臟邊緣出血性梗死灶（圖1-D）；回盲瓣出現(xiàn)潰瘍?cè)睿▓D1-E），結(jié)腸黏膜出現(xiàn)彌漫性糠麩樣壞死（圖1-F）。

圖1 感染豬臨床檢查及組織器官剖檢結(jié)果

2.2 組織病理學(xué)變化

各器官組織均有出血性病變，淋巴結(jié)出血（圖2-A），腎間質(zhì)彌漫性出血（圖2-B），腸黏膜出血（圖2-C），心臟出血（圖2-D）；回盲瓣及結(jié)腸黏膜纖維素性壞死（圖2-E），腦血管周圍淋巴細(xì)胞袖套樣浸潤(rùn)（圖2-F）。

圖2 病死豬各組織的病理變化（HE×400）

2.3 病毒分離鑒定

對(duì)PK15細(xì)胞培養(yǎng)分離得到的細(xì)胞毒，經(jīng)RTPCR擴(kuò)增驗(yàn)證確定為CSFV陽(yáng)性，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）均為陰性（圖3-A）。CSFV E2片段全長(zhǎng)擴(kuò)增如圖3-B所示。

2.4 核苷酸和氨基酸序列分析

利用DNAStar中的MegAlign，將新分離株（SDHZ-71）和參考毒株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果（表2）顯示：SDHZ-71與國(guó)內(nèi)的Shimen株、HCLV株及TWN株核苷酸序列同源性分別為83.4%、81.9%、81.9%，氨基酸序列同源性分別為90.1%、88.7%、89.3%；與國(guó)外的Alfort株和Paderborn株核苷酸同源性分別為86.8%、93.3%，氨基酸序列同源性為91.7%、95.7%；與本實(shí)驗(yàn)室2014年分離的SDJNa-14株的核苷酸和氨基酸同源性最高，分別為97.9%和98.7%；與本實(shí)驗(yàn)室2015年分離到的菏澤SDHZ-15株核苷酸和氨基酸序列同源性也較高，分別為97.1%和96.8%。

2.5 E2基因遺傳演化分析

圖3 E2基因擴(kuò)增瓊脂糖凝膠圖

表2 新分離株的E2基因與參考毒株同源性比對(duì)結(jié)果

選取50株CSFV的E2基因參考序列與本實(shí)驗(yàn)分離的毒株，利用MEGA6的Maximum- Likelihood方法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4）。E2基因分型結(jié)果顯示，新分離株SDHZ-71與SDHZ-14、SDJNa-15、Zj0801、SX-04等同屬于2.1d亞型，且與本實(shí)驗(yàn)室分離的SDHZ-14、SDJNa-15等在同一獨(dú)立分支上，表明該分離株仍為近幾年的流行毒株。

圖4 新分離株與參考毒株的遺傳進(jìn)化樹

2.6 E2基因推導(dǎo)氨基酸突變位點(diǎn)分析

將分離株與參考株的推導(dǎo)氨基酸進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離株與Shimen株相比，發(fā)生了23個(gè)氨基酸突變，在Fernandez-Sainz I等[5]預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)中有2個(gè)發(fā)生了突變，分別為805（NTT-NAT）807、986（NYAK-NYTK）989，其他糖基化位點(diǎn)均未發(fā)生變化；與所有參考株相比，發(fā)生了805（NTT-NAT）807的突變，但是否與其毒力或其他結(jié)構(gòu)相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

已知的抗原表位有717TTWKEYSH724，是A11的識(shí)別抗原表位[6]；771LLFDGTNP778是E2蛋白的一個(gè)線性B細(xì)胞表位[7]；829TAVSPTTLR837是一個(gè)高度保守的線性表位，為WH303的識(shí)別位點(diǎn)[8]；995YYEP998是瘟病毒屬保護(hù)性線性表位[9]。分離株的771LLFDGTNP778表位發(fā)生了N777S的突變，其他表位未發(fā)生變化。

3 討論

CSF是一種以體溫升高、全身性出血及高死亡率為特征的接觸性傳染病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害。自20世紀(jì)50年代，我國(guó)研制的CSFV兔化弱毒苗開(kāi)始普遍使用，對(duì)控制CSFV在我國(guó)的傳播起到了決定性作用。然而CSF在我國(guó)各地仍時(shí)有發(fā)生，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅[10]，而CSFV也隨時(shí)間變化不斷演變，產(chǎn)生了不同程度的突變，由以前的1.1亞型為主到現(xiàn)在的以2.1亞型為主[11-12]。本研究分離的毒株經(jīng)分子水平檢測(cè)及E2基因序列測(cè)定，確定為CSFV。

分離株SDHZ-71的核苷酸和氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示：SDHZ-71與本實(shí)驗(yàn)室分離的SDJNa-14同源性最高，分別為97.9%和98.7%，與2015年分離的菏澤SDHZ-15株也具有較高的同源性，分別為97.1%和96.8%；與HCLV、TWN的核苷酸和氨基酸的同源性最低，分別為81.9%/88.7%、81.9%/89.3%。這說(shuō)明分離株與近幾年分離的山東株差異性較小，而與HCLV、TWN等差異性較大。

遺傳進(jìn)化樹分析表明，分離株SDHZ-71與SDHZ-14、SDJNa-15、Zj0801、ZJ7.2005、SX-04等同屬于2.1d亞型分支，且與本實(shí)驗(yàn)室分離的SDHZ-14、SDJNa-15等在同一獨(dú)立分支上，核苷酸序列及氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果與遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。

CSFV糖蛋白中，E2是最主要的免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受CSFV攻擊[13]。E2的抗原位點(diǎn)主要分布在N端690～866位氨基酸殘基上，分為4個(gè)抗原區(qū)：A、B、C和D區(qū)，分 別 位 于766～865、690～799、693～716和775～788位氨基酸殘基之間[14]，其中693～716肽段可以提供免疫保護(hù)[15]。糖基化位點(diǎn)806N、875N的突變，尤其是突變?yōu)锳，將會(huì)導(dǎo)致CSFV毒力減弱[16]。而本分離株未發(fā)生突變，表明該途徑的毒力致弱并未發(fā)生。986N為功能性糖基化位點(diǎn)，其突變可引起E2蛋白分子量大小的改變[17]，但具體功能尚未明確，需進(jìn)一步研究。本分離株與Shimen株相比，由986NYAK989突變?yōu)?86NYTK989，與HCLV、Alfort等突變一致。本分離株與Shimen、HCLV等相比，與其他2.1亞型一致，也發(fā)生了由771LLFDGTNP778到771LLFDGTSP778的突變；相比其他參考毒株，發(fā)生了805（NTT-NAT）807糖基化位點(diǎn)的突變，其相關(guān)功能需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

氨基酸的部分突變會(huì)導(dǎo)致流行毒株毒力、抗原等功能性結(jié)構(gòu)的改變，可能是導(dǎo)致免疫失敗或免疫保護(hù)力下降，使免疫豬群頻發(fā)CSF的主要原因。當(dāng)然，最主要的原因還是豬群免疫不當(dāng)及生物安全措施缺失所致。因此，豬場(chǎng)應(yīng)精選及保管好CSF疫苗，科學(xué)設(shè)計(jì)疫苗免疫程序，并加強(qiáng)疫苗免疫效果評(píng)估[18]。同時(shí)，要走出過(guò)分依賴疫苗的誤區(qū)，將生物安全體系建設(shè)放在首位，積極探索封閉式、多點(diǎn)式飼養(yǎng)模式，嚴(yán)禁野毒株傳入；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激，積極做好豬場(chǎng)保健工作。