歸芪白術(shù)方對(duì)順鉑所致小鼠腎臟損傷的減毒作用

王磊，許小敏，張艷輝，劉永琦，張利英，張麗昕，張苡銘，何進(jìn)鵬，危文俊

化學(xué)療法能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，然而化療后患者的5年存活率并未得到明顯的提高，因?yàn)榛熕幵跉⑺滥[瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)其他正常的組織細(xì)胞也存在著殺傷作用。研究表明，化療藥的主要毒副作用包括免疫功能下降、炎癥反應(yīng)、肝腎毒性、神經(jīng)毒性、靜脈炎等[1-2]。因此，如何降低化療藥的毒副作用成為發(fā)展化學(xué)療法必須解決的關(guān)鍵難題。腎毒性是化療藥最常見(jiàn)的毒副作用，也是對(duì)機(jī)體損害較嚴(yán)重的毒副作用[3]，探索與研究降低化療藥腎臟毒性的藥物具有非常重要的意義。從中醫(yī)病因上來(lái)說(shuō)，化療藥的毒副作用屬于藥毒致病的范疇，在致病機(jī)制上常表現(xiàn)為各種臟腑的毒性損害或功能異常，因此在治療和預(yù)防上應(yīng)當(dāng)以扶正解毒、調(diào)理臟腑功能為主要治則治法[4-6]。歸芪白術(shù)方由黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、大黃、白芍、陳皮、炙甘草等中藥組成，具有益氣健脾、活血解毒、補(bǔ)血柔肝等功效，因此在理論上能夠有效減輕化療藥物引起的毒副作用。本研究從順鉑引起的腎臟損傷方面來(lái)探索歸芪白術(shù)方對(duì)化療藥毒副作用的減毒作用，以期為臨床上防治化療藥的毒副作用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 歸芪白術(shù)方中藥飲片免煎顆粒(黃芪12g、當(dāng)歸6g、白術(shù)6g、大黃4g、白芍9g、陳皮4g、炙甘草6g)購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，開(kāi)水沖散后，于酒精爐上再煮沸5min，每味飲片按小鼠與成人的用量換算系數(shù)同比換算成小鼠的用量，并分為歸芪白術(shù)方低劑量組(1/2正常用量)、中劑量(正常用量)和高劑量(2倍正常用量)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明小鼠50只，體重20±2g。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0001。

1.1.3 主要試劑和儀器 蛋白裂解液(貨號(hào)P0013C)、β巰基乙醇(貨號(hào)P0013C)、聚丙烯酰胺凝膠試劑盒(貨號(hào)P0013C)、過(guò)硫酰胺(貨號(hào)P0013C)、TEMED(貨號(hào)P0013C，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗caspase 3抗體(貨號(hào)ab13847)、抗caspase 9抗體(貨號(hào)ab202068，Abcam公司)；山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(貨號(hào)123450，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；4%多聚甲醛(貨號(hào)P1110，北京索萊寶公司)。分析天平(型號(hào)TEZ101-L，德國(guó)Sartorius公司)、臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)TDL-5-A，中國(guó)Thermo Fisher公司)、分光光度計(jì)(型號(hào)VIS-723N，北京瑞利分析儀器公司)、移液器(型號(hào)2.5、20、100、1000μl，美國(guó)Eppendorf公司)、倒置顯微鏡(型號(hào)DMIL-BFC295，德國(guó)Leica公司)，血球分析儀(型號(hào)CS1000i，日本Sysmex公司)、血清生化分析儀(型號(hào)Cabas8000，瑞士Roche公司)、電泳儀(型號(hào)EPS30，上海Biotech公司)，轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)Power pachc，上海Bio-Rad公司)、曝光儀(型號(hào)10U，美國(guó)Kodak公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將50只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為5組：空白組，模型組及歸芪白術(shù)方低、中、高劑量組，每組10只。模型組，歸芪白術(shù)方低、中、高劑量組每7d腹腔注射一次順鉑(劑量2.0mg/kg，每次0.2ml)，共注射4次；空白組每7d注射一次生理鹽水(劑量2.0mg/kg，每次0.2ml)，共注射4次。歸芪白術(shù)方低、中、高劑量組每日17:00均干預(yù)1次，每次灌胃0.4ml，空白組與模型組每日17:00用等量生理鹽水灌胃。各組小鼠每2d測(cè)量一次體重，每4d測(cè)量一次飲食情況，末次干預(yù)后48h收集血液樣本，腎臟大體形態(tài)拍照后固定、凍存腎臟組織樣本。

1.2.2 記錄、分析小鼠體重和飲食的變化情況 將每2d測(cè)得的各組小鼠體重按每組的平均體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共分析了12個(gè)時(shí)間點(diǎn)的體重變化，并繪制體重變化曲線；將每4d測(cè)得的飲食量按每組的平均飲食量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共分析6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的飲食量變化，并繪制飲食量變化曲線。

1.2.3 腎臟大體形態(tài)觀察 剝離各組小鼠腎臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干液體，按不同的分組分別置于一張白色的A4紙上，照相機(jī)拍照記錄各組小鼠腎臟大體形態(tài)，每組均分析10只小鼠，每只小鼠取一個(gè)腎臟進(jìn)行觀察。

1.2.4 各組小鼠血常規(guī)的檢測(cè) 每只小鼠收集200μl血液加入有抗凝劑的EP管中，采用血球分析儀檢測(cè)各組小鼠的血常規(guī)。

1.2.5 各組小鼠腎臟指數(shù)及腎臟功能的檢測(cè) 稱(chēng)量各組小鼠腎臟質(zhì)量，腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(mg)/大鼠的體重(g)。收集各組小鼠剩余的所有血液，離心后吸取血清，血清生化分析儀檢測(cè)各組小鼠的腎臟功能。

1.2.6 各組小鼠腎臟病理形態(tài)的觀察 HE染色觀察腎臟組織病理學(xué)變化，每張玻片選取3個(gè)清晰度較好的視野進(jìn)行腎臟組織病理評(píng)分。評(píng)分原則：0分，腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯變性、壞死及炎性浸潤(rùn)，腎小管結(jié)構(gòu)清晰；1分，腎臟組織結(jié)構(gòu)較正常，可見(jiàn)到輕微的變性、壞死、炎性浸潤(rùn)，腎小管結(jié)構(gòu)較清晰；2分，腎臟組織結(jié)構(gòu)改變明顯，可見(jiàn)到較多的變性、壞死、炎性浸潤(rùn)，腎小管結(jié)構(gòu)模糊；3分，腎臟組織結(jié)構(gòu)明顯異常，可見(jiàn)明顯的變性、壞死、炎性浸潤(rùn)，腎小管結(jié)構(gòu)模糊[7]。

1.2.7 各組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9表達(dá)量的檢測(cè) 取100mg腎臟組織加入400μl蛋白裂解液，在冰盒上充分研磨后靜置20min，充分裂解腎臟組織中的蛋白。4℃、12 000r/min離心10min，吸取上清，測(cè)量并調(diào)整蛋白濃度一致后，按1:5的比例加入上樣緩沖液，98℃金屬浴煮10min后，放入–80℃冰箱備用。配制12%及5%的電泳凝膠，每組上樣量為10μl，80V和120V進(jìn)行電泳分離蛋白；分離蛋白后用濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜100min，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2h；用5%脫脂牛奶配置的caspase 3(1:1000)、caspase 9(1:1000)、GAPDH(1:4000)一抗孵育，并放置于4℃標(biāo)本庫(kù)過(guò)夜；次日早上取出抗體，TBST洗滌3次，每次10min；用5%脫脂牛奶配制的山羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(1:4000)，室溫條件下孵育2h；TBST洗滌3次，每次10min，用ECL發(fā)光液顯影成像并洗出曝光的膠片；將GAPDH作為內(nèi)參，并用Image J軟件分析蛋白灰度值，計(jì)算caspase 3、caspase 9在各組中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重及飲食變化比較 空白組小鼠體重隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加；模型組小鼠體重呈周期性的降低和恢復(fù)；歸芪白術(shù)方低、中、高各劑量組的這種周期性降低得到一定緩解，其中歸芪白術(shù)方中劑量組緩解情況最明顯?？瞻捉M小鼠飲食量維持在一個(gè)較高的平均水平；模型組小鼠飲食量明顯降低；與模型組比較，歸芪白術(shù)方低、中、高各劑量組飲食量降低的趨勢(shì)有所緩解，其中歸芪白術(shù)方中劑量組緩解情況較明顯，但整體仍然呈明顯降低的趨勢(shì)(圖1)。

圖1 各組小鼠體重(A)及飲食量(B)的變化情況Fig.1 Changes of weight (A) and food intake (B) in each group of mice

2.2 各組小鼠腎臟大體形態(tài)比較 腎臟大體形態(tài)觀察可見(jiàn)，空白組小鼠腎臟顏色深紅，富有血液；模型組小鼠腎臟顏色明顯變淺，體積明顯較空白組變小；與模型組比較，歸芪白術(shù)方低、中、高各劑量組腎臟外觀得到改善，顏色較模型組加深，其中歸芪白術(shù)方中、高劑量組改善較明顯，歸芪白術(shù)方低劑量組有輕微改善。

2.3 各組小鼠血常規(guī)比較 血常規(guī)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)明顯降低(P＜0.05)，而紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)無(wú)明顯變化；與模型組比較，歸芪白術(shù)方中、高劑量組WBC、PLT明顯升高(P＜0.05)，RBC、HGB的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 各組小鼠血常規(guī)的變化情況(±s，n=10)Tab.1 Changes of blood routine in each group of mice (±s, n=10)

表1 各組小鼠血常規(guī)的變化情況(±s，n=10)Tab.1 Changes of blood routine in each group of mice (±s, n=10)

WBC. White blood cell; RBC. Red blood cell; HGB. Hemoglobin; PLT. Platelet; (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with Guiqi Baizhu prescription low dose group

WBC (109/L) RBC (1012/L) HGB (g/L) PLT (g/L)Control group 12.48±1.67 9.95±0.59 154.33±9.87 993.67±173.34 Model group 4.37±0.30(1) 9.31±0.69(1) 154.00±10.58(1) 629.67±134.11(1)Guiqi Baizhu prescription low dose group 5.06±1.62 9.40±0.49 153.00±11.53 809.33±62.31 Guiqi Baizhu prescription medium dose group 7.63±0.08(2)(3) 9.35±0.17(2)(3) 143.00±2.83(3) 889.50±81.32(3)Guiqi Baizhu prescription high dose group 7.46±1.46(2) 9.69±0.91(2) 152.67±9.87 918.00±49.37 F 131.812 5.182 8.703 25.639 P 0.000 0.001 0.000 0.000 Group

2.4 各組小鼠腎臟指數(shù)及腎臟功能比較 與空白組比較，模型組小鼠腎臟指數(shù)明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，歸芪白術(shù)方低、中、高劑量組小鼠腎臟指數(shù)明顯升高，其中歸芪白術(shù)方中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與空白組比較，模型組小鼠BUN、Scr含量明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，歸芪白術(shù)方低、中、高劑量組小鼠BUN含量均明顯降低，而Scr含量?jī)H在歸芪白術(shù)方中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表2 各組小鼠腎臟指數(shù)及腎臟功能的變化情況(±s，n=10)Tab.2 Changes of renal index and renal function in each group of mice (±s, n=10)

表2 各組小鼠腎臟指數(shù)及腎臟功能的變化情況(±s，n=10)Tab.2 Changes of renal index and renal function in each group of mice (±s, n=10)

BUN. Blood urea nitrogen; Scr. Serum creatinine; (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with Guiqi Baizhu prescription low dose group

Renal index (mg/g) BUN (mmol/L) Scr (μmol/L)Control group 13.02±0.82 9.50±1.47 20.67±3.21 Model group 8.68±1.84(1) 13.10±0.79(1) 45.33±10.41(1)Guiqi Baizhu prescription low dose group 9.58±1.94 12.43±1.85(2) 40.00±7.00 Guiqi Baizhu prescription medium dose group 10.83±0.96(2)(3) 11.20±1.32(2)(3) 36.33±4.51(2)(3)Guiqi Baizhu prescription high dose group 11.05±0.60(2) 11.17±0.50(2) 23.33±2.52(2)F 47.410 41.075 54.697 P 0.000 0.000 0.000 Group

2.5 各組小鼠腎臟組織病理改變比較 HE染色可見(jiàn)，空白組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)變性、壞死及炎性浸潤(rùn)等，腎小管結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，病理評(píng)分為(0.34±0.24)分；模型組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)明顯異常，腎小管結(jié)構(gòu)濁腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，近曲小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)較多的氣球樣變，部分萎縮或消失，病理評(píng)分為(2.07±0.49)分，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；歸芪白術(shù)方各劑量組小鼠腎臟組織病理?yè)p傷較模型組有所減輕，腎小管濁腫程度得到緩解，近曲小管上皮細(xì)胞氣球樣變、萎縮程度均得到改善，其中歸芪白術(shù)方低、中、高劑量組病理評(píng)分分別為(1.86±0.42)分、(1.34±0.28)分、(1.68±0.58)分，與模型組比較，中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)變化(HE ×20)Fig.2 Pathological changes of kidney tissues in each group of mice (HE ×20)

2.6 各組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9表達(dá)量比較 Western blotting結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)；而與模型組比較，歸芪白術(shù)方各劑量組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達(dá)量均下調(diào)；其中歸芪白術(shù)方中劑量組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9表達(dá)量的下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)歸芪白術(shù)方低、高劑量組小鼠腎臟組織中caspase 3表達(dá)量的下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 各組小鼠腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達(dá)情況Fig.3 Expressions of caspase 3 and caspase 9 in kidney tissue of each group of mice

3 討 論

順鉑是腫瘤化療的常用藥物之一，能夠有效阻止癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，并最終殺滅癌細(xì)胞，然而順鉑在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)，也不可避免地會(huì)損傷人體正常細(xì)胞，從而出現(xiàn)藥物的副作用[8-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，化療后部分化療藥物廣泛分布于機(jī)體各組織器官并蓄積于腎臟組織，并且主要通過(guò)腎臟組織排泄，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究表明，順鉑等化療藥物在96h內(nèi)有25%～45%通過(guò)尿液排出體外[11]。大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常的腎臟組織及細(xì)胞也具有不同程度的損害，主要表現(xiàn)為腎小管損傷，臨床上可表現(xiàn)為血尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)升高，肌酐清除率降低，反復(fù)高劑量治療則可致持久性輕、中度腎損害[12]?；熕幬飳?duì)腎臟的毒副作用主要表現(xiàn)為氧化損傷，引發(fā)凋亡、炎癥反應(yīng)等[13-15]?；熕幬锟赏ㄟ^(guò)激活MAPK凋亡相關(guān)通路，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白caspase 3、caspase 9等的表達(dá)，誘導(dǎo)腎臟組織細(xì)胞的凋亡[16]。從中醫(yī)學(xué)辨證論治上來(lái)講，順鉑的毒副作用屬于藥毒致病的范疇，在致病機(jī)制上表現(xiàn)為臟腑的毒性損害以及功能異常，因此在治療和預(yù)防上應(yīng)當(dāng)以扶正解毒、調(diào)理臟腑功能等為主要治則治法。同時(shí)現(xiàn)代研究也證實(shí)益氣扶正的中藥對(duì)順鉑引起的腎臟毒性具有一定的減毒作用[17]。歸芪白術(shù)方由《普濟(jì)方》卷二七二之“黃芪膏”加味制備而成，由黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、大黃、白芍、陳皮、炙甘草等7味中藥組成，該方攻補(bǔ)兼施、扶正與祛邪兼顧，諸藥共奏益氣補(bǔ)血、活血解毒、健脾疏肝等功效，臨床上常用于氣血不足、血瘀毒結(jié)等病癥，因此，從中醫(yī)學(xué)上來(lái)講歸芪白術(shù)方能夠有效減輕順鉑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒副作用。

飲食情況和體重變化反映了小鼠的生存質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)觀察到小鼠注射順鉑后，體重和飲食量均明顯降低，提示順鉑引起了小鼠生存質(zhì)量的降低；給予歸芪白術(shù)方后，小鼠的體重以及飲食量增加。順鉑最常見(jiàn)的副作用是腎臟損害[18]，故推測(cè)順鉑引起小鼠生存質(zhì)量降低可能與其腎毒性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)順鉑腎臟毒性的研究，探索歸芪白術(shù)方減輕順鉑腎臟毒性，提高生存質(zhì)量的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，順鉑可引起小鼠腎臟顏色明顯變淺，體積明顯變小，給予歸芪白術(shù)方后小鼠腎臟顏色加深，體積增大。血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)，注射順鉑后WBC、PLT明顯降低，給予歸芪白術(shù)方后WBC、PLT有所升高。腎臟指數(shù)和腎臟功能分析顯示，注射順鉑后腎臟指數(shù)明顯降低，BUN、Scr含量明顯升高，給予歸芪白術(shù)方后腎臟指數(shù)有所升高，BUN、Scr含量有所降低。腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)，注射順鉑后腎臟組織出現(xiàn)了明顯的病理?yè)p傷，歸芪白術(shù)方干預(yù)后腎臟病理?yè)p傷得到緩解，中劑量組緩解最為明顯。即往研究表明，順鉑的腎毒性主要表現(xiàn)在可引起腎臟組織細(xì)胞的凋亡等[19]，因此本研究檢測(cè)了各組小鼠腎臟組織中促凋亡相關(guān)蛋白caspase 3、caspase 9的表達(dá)情況，結(jié)果可見(jiàn)注射順鉑后腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達(dá)明顯上調(diào)，給予歸芪白術(shù)方后腎臟組織中caspase 3、caspase 9的表達(dá)降低，以歸芪白術(shù)方中劑量組最為明顯。該結(jié)果提示，歸芪白術(shù)方對(duì)順鉑引起的腎臟損傷的保護(hù)作用無(wú)明顯的量效關(guān)系，這可能與中藥復(fù)方中各個(gè)成分的劑量和配伍有關(guān)，并不能認(rèn)為中藥復(fù)方劑量越大效果越好，這也間接證實(shí)了中藥復(fù)方合理劑量及配伍的重要性。本研究較系統(tǒng)地探索了歸芪白術(shù)方減輕順鉑腎臟損傷的作用機(jī)制，結(jié)果顯示可能與其改善血液活力、減少腎臟細(xì)胞的凋亡有關(guān)，這與中醫(yī)學(xué)認(rèn)為歸芪白術(shù)方可通過(guò)益氣補(bǔ)血、活血解毒等作用減輕順鉑的腎臟毒副作用的觀點(diǎn)一致。

本研究通過(guò)檢測(cè)注射順鉑后各干預(yù)組小鼠體重、飲食變化的情況，評(píng)估了各組小鼠的生存質(zhì)量，并推測(cè)順鉑導(dǎo)致小鼠生存質(zhì)量降低的原因可能與順鉑的腎臟毒性相關(guān)。因此進(jìn)一步檢測(cè)了注射順鉑后各干預(yù)組小鼠腎臟大體形態(tài)變化、血常規(guī)變化、腎臟指數(shù)及腎臟功能變化、腎臟組織病理學(xué)改變、腎臟組織中促凋亡蛋白caspase 3和caspase 9的表達(dá)情況，從而對(duì)歸芪白術(shù)方減輕順鉑所致小鼠腎臟損害的作用及其機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的探索和研究。雖然本研究結(jié)果顯示歸芪白術(shù)方對(duì)順鉑所致腎臟損害具有防治作用，然而臨床上的療效如何，是否具有等效作用還有待進(jìn)一步的臨床研究并根據(jù)臨癥時(shí)的加減變化等進(jìn)行調(diào)整。