• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    慢性充血性心力衰竭兔左心室三層心肌間Cx43表達(dá)的差異及其意義

    2019-01-17 02:40:30吳美霞劉亞軍陸士娟孫定軍吳淼張偉黃康鐘江華
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2018年11期
    關(guān)鍵詞:左心室心肌細(xì)胞染色

    吳美霞,劉亞軍,陸士娟,孫定軍,吳淼,張偉,黃康,鐘江華

    慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)主要為老年發(fā)病,病情復(fù)雜且兇險(xiǎn),容易引發(fā)惡性室性心律失常(MVA),隨之出現(xiàn)心源性猝死(SCD)[1]。目前有調(diào)查顯示,約75%的老年CHF患者猝死與MVA有關(guān)[2]。但迄今為止,CHF易發(fā)MVA的生理機(jī)制仍未明確,因而缺乏有效的預(yù)防及控制措施。近年來有研究發(fā)現(xiàn)MVA的發(fā)生可能與跨室壁復(fù)極離散(TDR)有關(guān)[3]。成人心臟在解剖上由心內(nèi)膜下心肌(Endo)、中層心肌(Mid)及心外膜下心肌(Epi)組成,其中Mid的復(fù)極化持續(xù)時(shí)間比另外兩層心肌明顯延長(zhǎng),從而造成TDR。在某些病理?xiàng)l件下,這種心肌橫斷面上的復(fù)極差異還會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大[4],容易誘發(fā)MVA,但其發(fā)生的蛋白分子機(jī)制并不清楚。

    縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)廣泛參與左心室心肌細(xì)胞和傳導(dǎo)系統(tǒng)的各種工作,通過相鄰細(xì)胞間電、化學(xué)信號(hào)通路參與MVA的發(fā)生發(fā)展[3]。Chang等[5]在大鼠心肌梗死(MI)模型中發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)明顯降低,且梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)功能受損,說明MVA與Cx43的異質(zhì)性有關(guān)。本研究通過縮窄腹主動(dòng)脈建立CHF兔模型,觀察其左心室三層心肌間Cx43表達(dá)的差異,旨在探討CHF發(fā)生MVA的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物分組及模型制作 24只雄性健康新西蘭大白兔,體重(2.5±0.5)kg,由杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)提供[合格證號(hào):SCXK(浙)2013-0055]。將24只兔隨機(jī)分為CHF組(n=12)和假手術(shù)組(Sham組,n=12)。CHF組兔稱重后經(jīng)耳緣靜脈用氨基甲酸乙酯(1.0g/kg)麻醉,腹部常規(guī)消毒,正中線切開,沿左腎動(dòng)脈上方游離出腹主動(dòng)脈并鈍性分離,用5F或6F導(dǎo)管平行于腹主動(dòng)脈,4號(hào)線結(jié)扎,取出導(dǎo)管,使腹主動(dòng)脈橫截面積狹窄約為70%[6]。Sham組開腹后不結(jié)扎腹主動(dòng)脈,其余步驟同CHF組。兩組兔均在縫合切口后青霉素連續(xù)肌內(nèi)注射3d以預(yù)防感染,術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)8周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 溶液制備 ①10%過硫酸銨(AP):超純水1.0ml和過硫酸胺0.1g溶解后,于4℃保存1周;②電泳緩沖液:Tris[重均分子量(MW)121.14]3.04g、甘氨酸(MW 75.07)14.42g、十二烷基硫酸鈉(SDS)0.5g加蒸餾水至1000ml;③轉(zhuǎn)移緩沖液:甘氨酸(MW 75.07)14.42g、Tris(MW 121.14)3.04g、甲醇200ml加蒸餾水至1000ml;④TBST緩沖液:Tris(MW 121.14)1.22g、NaCl 2.92g、Tween 20 0.5ml加蒸餾水至1000ml;⑤封閉液:脫脂奶粉5g加TBST緩沖液100ml。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 在體心臟超聲檢查 兔喂養(yǎng)8周后稱重,并通過耳靜脈用1.0g/kg氨基甲酸乙酯靜脈麻醉,取仰臥位,固定兔的四肢,采用超聲掃描儀(ATLHDI-5000型)在胸骨旁左室長(zhǎng)軸掃描,通過心臟彩超檢查兔的左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD),左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、室間隔厚度(IVS)、左心室后壁厚度(LVPW)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

    1.3.2 在體血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 分離并切開右頸總動(dòng)脈,然后插入含有1%肝素的直徑約1mm心導(dǎo)管,緩慢推進(jìn)的同時(shí)接BL-420S生物機(jī)能分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司),穩(wěn)定5min后,測(cè)量其外周動(dòng)脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)、左心室最大上升速度和最大下降速度(±dp/dtmax)等參數(shù)。

    1.3.3 左心室三層心肌的提取 兔稱重后處死,剪取心臟,用濾紙吸干生理鹽水洗凈的心臟,分別稱量整個(gè)心臟重量(HW)和左心室重量(LVW),計(jì)算心臟重量比(HW/BW)和左心室重量比(LVW/BW)。按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]剪取兔左心室游離壁,并用刀片分離三層心肌組織,其中Epi為心外膜面至其下2mm,Mid為心外膜面下2~7mm,Endo為心內(nèi)膜面至其下2mm。將上述提取出的組織分別用Eppendorf管凍存于-80℃冰箱中備用。

    1.3.4 左心室心肌HE染色及免疫組化染色 取左心室心肌組織,用4%聚合甲醛溶液沖洗,在石蠟包埋之前進(jìn)行固定、脫水然后切片,厚度約為4μm,常規(guī)行HE染色。石蠟包埋的左心室不同心肌層切片用于Cx43表達(dá)的免疫組化染色檢測(cè),脫蠟、水合和抗原修復(fù)后,在室溫下用1%BSA封閉組織45min,切片加入一抗孵育過夜,并用生物素化標(biāo)記二抗1h,然后用ABC過氧化物酶和DAB(二氨基聯(lián)苯胺)孵育,蘇木素復(fù)染,并在光鏡下觀察,Cx43陽(yáng)性為深棕黃色,陰性不顯色[8]。對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)測(cè)定免疫組化圖像中的平均光密度值。

    1.3.5 Western blotting檢測(cè)左心室心肌Cx43蛋白表達(dá) 將兩組兔心肌組織溶解在裂解緩沖液內(nèi),提取蛋白后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。在SDS丙烯酰胺凝膠上負(fù)載30μg蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用發(fā)光體化學(xué)發(fā)光法針對(duì)Cx43、GAPDH和二次抗體(辣根過氧化物酶)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。將目標(biāo)蛋白/參考蛋白的半定量值作為Cx43蛋白的表達(dá)水平,用Cx43-pro代表左心室三層心肌的Cx43蛋白的含量;左心室壁心肌間最大Cx43-pro與最小Cx43-pro的差值用ΔCx43-pro表示,反映跨室壁Cx43蛋白表達(dá)的差異。

    1.3.6 RT-qPCR檢測(cè)左心室Cx43 mRNA的表達(dá)用Trizol試劑提取心肌總RNA,并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后將100ng cDNA作為模板,加入1μl正反引物,行RT-qPCR反應(yīng),每個(gè)樣品最終體積為20μl。RT-qPCR反應(yīng)條件為:95℃變性1min;60℃擴(kuò)增30s,95℃變性10s,隨后循環(huán)40次。熔解曲線從70℃增加到95℃,每5s增加0.5℃。qPCR擴(kuò)增過程中收集熒光,反應(yīng)結(jié)束后,分析、計(jì)算qPCR過程各檢測(cè)樣本熒光信號(hào)能被檢測(cè)到的循環(huán)閾值(Ct值),并計(jì)算樣本的Cx43 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)(Cq值)用于反映Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平[9]。左心室壁心肌最大Cx43-Cq與最小Cx43-Cq的差值用ΔCx43-Cq表示,反映跨室壁Cx43 mRNA表達(dá)的差異。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),進(jìn)一步兩兩比較方差齊時(shí)采用SNK-q檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Tamhane'sT2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)CHF組兔存活9只,死亡3只,Sham組全部存活。在體血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示,與Sham組比較,CHF組SBP、DBP、MAP及±dp/dtmax均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1)。與Sham組比較,CHF組HW/BW及LVW/HW明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。心臟病理切片檢查結(jié)果顯示,CHF組心肌細(xì)胞體積增大、直徑增寬,細(xì)胞排列不規(guī)則、染色不均勻,間質(zhì)纖維化明顯,而Sham組心肌細(xì)胞體積、直徑正常,細(xì)胞排列規(guī)則,間質(zhì)無明顯纖維化,組織學(xué)表現(xiàn)正常(圖1)。

    表1 兩組兔一般資料比較(±s)Tab.1 Basic data of the two groups of rabbits (±s)

    表1 兩組兔一般資料比較(±s)Tab.1 Basic data of the two groups of rabbits (±s)

    (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with sham group

    Item Sham group (n=12) CHF group (n=9)HW/BW 0.20±0.01 0.25±0.03(1)LVW/HW 0.15±0.01 0.18±0.02(1)SBP (mmHg) 151.14±21.75 134.16±5.78(2)DBP (mmHg) 110.24±18.56 93.40±3.64(2)MAP (mmHg) 74.32±7.06 58.89±2.40(2)+dp/dtmax (mmHg/ms) 3.56±0.40 3.40±0.71(1)–dp/dtmax (mmHg/ms) –2.91±0.07 –2.88±0.47(1)

    圖1 兩組兔左心室心肌病理切片觀察(HE染色)Fig.1 Pathological observation of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (HE staining)

    2.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果 與Sham組比較,CHF組LVEF降低,LVEDD、LVESD明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而IVS、LVPW比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。

    表2 兩組兔超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)Tab.2 Results of echocardiography in the two groups of rabbits (±s)

    表2 兩組兔超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)Tab.2 Results of echocardiography in the two groups of rabbits (±s)

    (1)P<0.05 compared with sham group

    Item Sham group (n=12) CHF group (n=9)LEVF(%) 79.23±0.08 49.67±0.15(1)LVEDD(mm) 9.54±1.75 14.32±1.98(1)LVESD(mm) 6.46±0.67 9.12±1.66(1)IVS(mm) 3.35±0.87 3.12±0.22 LVPW(mm) 3.54±0.57 3.65±0.30

    2.3 左心室三層心肌Cx43蛋白的表達(dá)的Western blotting檢測(cè)結(jié)果 CHF組Epi、Mid及Endo的Cx43蛋白表達(dá)水平(分別為43.76±2.43、32.49±2.27及44.28±4.75)均明顯低于Sham組(分別為56.23±2.45、50.43±4.56、58.65±3.21),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組組內(nèi)比較,Endo的Cx43蛋白表達(dá)水平明顯高于Mid、Epi,而Epi的Cx43蛋白表達(dá)水平明顯高于Mid,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CHF組的ΔCx43-pro(15.37±2.08)明顯高于Sham組(11.19±1.48,P<0.05,圖2)。

    圖2 兩組兔左心室三層心肌Cx43蛋白的表達(dá)(Western blotting)Fig.2 Expression of Cx43 protein in three layers of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (Western blotting)

    2.4 左心室三層心肌間Cx43蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 CHF組Endo、Mid及Epi的Cx43蛋白表達(dá)水平(分別為2.69±0.31、2.03±0.29、2.54±0.33)明顯低于Sham組(分別為3.72±0.12、3.59±0.13、3.69±0.17),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CHF組各層心肌深棕黃色顆粒較Sham組明顯減少,且三層心肌中以Mid減少最為顯著(圖3)。

    圖3 兩組兔左心室三層心肌Cx43蛋白的表達(dá)(免疫組化染色)Fig.3 Expressions of Cx43 protein in three layers of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (Immunohistochemical staining)

    2.5 RT-PCR檢測(cè)左心室三層心肌間Cx43 mRNA的表達(dá) CHF組Epi、Mid及Endo的Cx43 mRNA表達(dá)(Cq值分別為21.07±1.02、17.54±1.08及20.62±1.21)明顯低于Sham組(Cq值分別為23.45±0.98、22.48±1.08、24.87±1.45),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組組內(nèi)比較,Endo的Cx43 mRNA明顯高于Mid、Epi,Epi的Cx43 mRNA明顯高于Mid,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CHF組的ΔCx43-Cq(4.26±0.27)較Sham組(2.22±0.48)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

    圖4 RT-PCR檢測(cè)兩組兔左心室三層心肌Cx43 mRNA表達(dá)Fig.4 Expressions of Cx43 mRNA in three layers of left ventricular myocardium in the two groups of rabbits (RT-PCR)

    3 討 論

    CHF是因心臟結(jié)構(gòu)改變、功能和代謝紊亂引起心臟擴(kuò)大、心室充盈受損及心臟射血能力下降的臨床綜合征[10-11],是各種類型心臟疾病發(fā)展的最后階段。本研究通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)建立兔CHF模型,CHF組兔死亡3只,模型成活率75%。術(shù)后8周CHF組的LEVF<50%,且LVEDD、LVESD增高,提示兔造模8周后心臟收縮功能及舒張功能均明顯受損。此外,通過頸動(dòng)脈插管也證實(shí),CHF組SBP、DBP及左心室±dp/dtmax明顯降低,表明CHF兔心臟泵功能明顯降低,心臟逐漸喪失代償能力。病理結(jié)果顯示,CHF組心肌細(xì)胞體積變大,直徑加寬,細(xì)胞排列混亂、染色不一,間質(zhì)有明顯的纖維化現(xiàn)象,與CHF的病理表現(xiàn)相同,證明本研究成功建立了可靠的CHF動(dòng)物模型。

    MVA是CHF的一種常見并發(fā)癥,其死亡發(fā)生率高達(dá)50%~60%,更是CHF患者突發(fā)SCD的常見因素[12]。Cx43主要負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞間電位的快速傳送,在電流傳導(dǎo)中具有重要作用[13]。研究表明,Cx43蛋白主要在心肌細(xì)胞中豐富表達(dá),作為心室肌電流傳導(dǎo)的介質(zhì)并維持搏動(dòng)節(jié)律,是MVA發(fā)生的潛在基礎(chǔ)[14]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),右心室發(fā)育不良導(dǎo)致心律失常的患者存在Cx43蛋白的減少及分布異常,且可發(fā)生持續(xù)性心動(dòng)過速[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在心肌肥厚小鼠中Cx43分布的空間異質(zhì)性增加,出現(xiàn)了Cx43的去磷酸化,Cx43的去磷酸化可導(dǎo)致耦聯(lián)受損,引起傳導(dǎo)阻滯,從而增加了MVA的易患性,心電圖表現(xiàn)為QRS波延長(zhǎng)[16]。本研究結(jié)果顯示,CHF組左心室三層心肌的Cx43蛋白表達(dá)均明顯低于Sham組,這可能是CHF易發(fā)MVA的重要原因之一。

    近年來,國(guó)內(nèi)外還有研究認(rèn)為跨室壁電生理差異性是心室壁固有的心電現(xiàn)象[17]。而Mid具有特殊的電生理特性,這種特殊性在于:在各種離子交換產(chǎn)生的作用下,Mid的動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間較Endo及Epi延長(zhǎng),這種差異使得心臟在不同的層面上出現(xiàn)復(fù)極異常,也就是TDR。本研究的Western blotting及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均表明,Sham組兔的Cx43在三層心肌橫斷面上存在表達(dá)差異,Mid的Cx43蛋白及mRNA表達(dá)均明顯少于Epi及Endo,由此可見,左心室三層心肌間的Cx43表達(dá)差異可能是心肌不同層面電生理異質(zhì)性的蛋白基礎(chǔ)。

    此外,左心室壁各層心肌細(xì)胞不僅復(fù)極時(shí)程不一致,對(duì)其他疾病如心肌梗死和CHF產(chǎn)生的復(fù)極作用也不盡相同,這些差異性會(huì)增加心肌細(xì)胞有效不應(yīng)期的離散,使TDR增大,進(jìn)而更加容易引起MVA[17],但是各層心肌復(fù)極化不一致的蛋白機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn),小鼠心肌梗死模型中Cx43含量降低,MVA的發(fā)生率明顯增加,而增加Cx43表達(dá)后,發(fā)生MVA的敏感性減弱[18]。Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,缺血組心肌細(xì)胞活性降低,Cx43含量減少且分布出現(xiàn)異常,MVA發(fā)生的評(píng)分率也增加,而加入增加心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)的藥物后,其發(fā)生MVA的機(jī)會(huì)明顯減少。以上結(jié)果均表明,器質(zhì)性心臟病的心肌Cx43表達(dá)水平降低在心律失常的發(fā)生中起到了一定的作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),CHF三層心肌Cx43蛋白表達(dá)水平下降的同時(shí),ΔCx43-pro和ΔCx43-Cq明顯增大,Cx43在心肌各層面上的表達(dá)差異性進(jìn)一步擴(kuò)大,這可能使CHF的TDR增大,從而更易發(fā)生SCD。導(dǎo)致Cx43在各層心肌表達(dá)差異性擴(kuò)大的潛在因素有很多,可能與CHF心肌細(xì)胞之間的Cx43異常表達(dá)造成神經(jīng)體液調(diào)節(jié)失衡、細(xì)胞間的互相制約減弱及心電傳導(dǎo)推遲有關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn),CHF患者血漿中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)含量升高,而接受血管緊張素受體阻滯劑的患者其血漿中拮抗AngⅡ的物質(zhì)增多[21]。此外AngⅡ可能通過促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞(CFs)增殖和轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致心肌纖維化,降低Cx43的滲透性,從而損害心臟細(xì)胞之間化學(xué)信息的傳遞,造成了心臟電生理障礙[22-23]。

    總之,Cx43異質(zhì)性的擴(kuò)大可能會(huì)擾亂左心室心電活動(dòng)的平衡,繼而使心臟發(fā)生MVA的機(jī)會(huì)明顯增高,而具有減輕左心室各層心肌Cx43表達(dá)異常作用的藥物,將能夠減少Cx43三層心肌間復(fù)極的不一致,提高心室顫動(dòng)閾值,減少M(fèi)VA的發(fā)生。本研究的觀察時(shí)間跨度相對(duì)較小,而心肌重塑進(jìn)而形成CHF是一個(gè)長(zhǎng)期的漸進(jìn)性病理過程,因此,今后的研究可以選擇不同的時(shí)間長(zhǎng)度來觀察Cx43表達(dá)異質(zhì)性的變化,并進(jìn)一步探討這種異質(zhì)性所引起的心電離子通道改變的機(jī)制。

    猜你喜歡
    左心室心肌細(xì)胞染色
    左歸降糖舒心方對(duì)糖尿病心肌病MKR鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響
    活血解毒方對(duì)缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞凋亡的影響
    心電向量圖診斷高血壓病左心室異常的臨床應(yīng)用
    平面圖的3-hued 染色
    簡(jiǎn)單圖mC4的點(diǎn)可區(qū)別V-全染色
    心肌細(xì)胞慢性缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展
    油紅O染色在斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    槲皮素通過抑制蛋白酶體活性減輕心肌細(xì)胞肥大
    初診狼瘡腎炎患者左心室肥厚的相關(guān)因素
    兩類冪圖的強(qiáng)邊染色
    美女黄网站色视频| 美女 人体艺术 gogo| 老司机福利观看| 久久亚洲国产成人精品v| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产美女午夜福利| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本黄色视频三级网站网址| 久久亚洲精品不卡| 在线观看午夜福利视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| 国产一区二区三区av在线 | 国产午夜精品一二区理论片| 国产爱豆传媒在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 精品一区二区三区人妻视频| 精品久久国产蜜桃| 乱系列少妇在线播放| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲成人久久性| 国产成年人精品一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 晚上一个人看的免费电影| 国产伦一二天堂av在线观看| av国产免费在线观看| 床上黄色一级片| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩成人av中文字幕在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 久久午夜福利片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 99热这里只有精品一区| 性欧美人与动物交配| 国产精品蜜桃在线观看 | 99久久精品一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 三级经典国产精品| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲真实伦在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品免费一区二区三区在线| 丰满的人妻完整版| 国产精品av视频在线免费观看| 精品久久久久久久久av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美高清性xxxxhd video| 麻豆av噜噜一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区 | 日韩欧美精品免费久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美成人a在线观看| 丝袜美腿在线中文| 国产黄色小视频在线观看| av卡一久久| 熟女人妻精品中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| or卡值多少钱| 欧美精品国产亚洲| 美女国产视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久久久久九九精品二区国产| 看十八女毛片水多多多| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产麻豆成人av免费视频| 成人av在线播放网站| 日韩欧美精品免费久久| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 激情 狠狠 欧美| 我要搜黄色片| videossex国产| or卡值多少钱| 春色校园在线视频观看| 日韩强制内射视频| 国产成年人精品一区二区| 久久久精品94久久精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久人人爽人人片av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| kizo精华| 在线天堂最新版资源| 国产 一区精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 少妇的逼好多水| 亚洲国产欧美在线一区| 九九热线精品视视频播放| 18禁在线播放成人免费| 国产精品精品国产色婷婷| 成人特级av手机在线观看| 久久久久久大精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 插阴视频在线观看视频| 免费观看人在逋| 国产精品日韩av在线免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 中国美白少妇内射xxxbb| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久精品91蜜桃| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费无遮挡裸体视频| 特级一级黄色大片| 色哟哟哟哟哟哟| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 黄片wwwwww| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 九色成人免费人妻av| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲七黄色美女视频| 日韩高清综合在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 校园春色视频在线观看| 丝袜喷水一区| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品自拍成人| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品伦人一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 国国产精品蜜臀av免费| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品.久久久| 亚州av有码| 热99re8久久精品国产| 国产免费男女视频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲精品456在线播放app| 黄色日韩在线| 成年女人永久免费观看视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 内地一区二区视频在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久精品94久久精品| 在线播放国产精品三级| 2022亚洲国产成人精品| 99riav亚洲国产免费| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品福利在线免费观看| 春色校园在线视频观看| 亚洲在久久综合| 久久久久久伊人网av| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 在线观看av片永久免费下载| 九草在线视频观看| 1000部很黄的大片| 九色成人免费人妻av| 麻豆成人午夜福利视频| 国产av麻豆久久久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕制服av| 天天一区二区日本电影三级| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚州av有码| 国产精品久久视频播放| 亚洲久久久久久中文字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 一本久久中文字幕| 三级毛片av免费| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美日韩在线观看h| 久久久久久久午夜电影| 午夜福利在线观看吧| 99热6这里只有精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久久欧美国产精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | av天堂在线播放| av在线播放精品| 日本一本二区三区精品| 九色成人免费人妻av| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产av一区在线观看免费| 久久精品人妻少妇| 一本久久精品| 看免费成人av毛片| 亚洲精品国产成人久久av| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲成人久久性| 亚洲七黄色美女视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美精品专区久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲三级黄色毛片| www.色视频.com| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品.久久久| 国产一区二区激情短视频| 人妻久久中文字幕网| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲七黄色美女视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 中文欧美无线码| 最后的刺客免费高清国语| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 91久久精品电影网| 亚洲高清免费不卡视频| av在线亚洲专区| 黑人高潮一二区| 99热全是精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩精品有码人妻一区| 美女高潮的动态| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费观看人在逋| 日韩视频在线欧美| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 青春草视频在线免费观看| 国产不卡一卡二| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲经典国产精华液单| 观看美女的网站| 天堂网av新在线| 五月伊人婷婷丁香| 热99re8久久精品国产| 熟女电影av网| 免费人成视频x8x8入口观看| 99久久精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 51国产日韩欧美| 国产高清不卡午夜福利| 日韩av在线大香蕉| 日韩国内少妇激情av| 长腿黑丝高跟| 真实男女啪啪啪动态图| 日本一本二区三区精品| 少妇丰满av| 午夜激情欧美在线| 悠悠久久av| 69av精品久久久久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲自偷自拍三级| 午夜精品国产一区二区电影 | 男人和女人高潮做爰伦理| 久久鲁丝午夜福利片| 一级毛片电影观看 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲av成人av| 国产综合懂色| 久久久成人免费电影| 人妻系列 视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| av卡一久久| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩强制内射视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久久久久亚洲中文字幕| 美女国产视频在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产精品福利在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久久久久久大av| 干丝袜人妻中文字幕| 日本黄大片高清| 国产精品久久视频播放| 国产免费男女视频| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产三级中文精品| 亚洲四区av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 五月伊人婷婷丁香| 久久草成人影院| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久国内精品自在自线图片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 91久久精品国产一区二区成人| 久久亚洲国产成人精品v| 床上黄色一级片| 丝袜喷水一区| 国产成人91sexporn| 成熟少妇高潮喷水视频| av国产免费在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产高潮美女av| 免费观看的影片在线观看| 看十八女毛片水多多多| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美成人a在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久网色| 两个人的视频大全免费| 国产片特级美女逼逼视频| 在线观看免费视频日本深夜| 最后的刺客免费高清国语| 色综合色国产| 丝袜美腿在线中文| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩成人av中文字幕在线观看| kizo精华| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产在线男女| 日韩强制内射视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲最大成人av| 国产av麻豆久久久久久久| 五月玫瑰六月丁香| 午夜精品一区二区三区免费看| av免费在线看不卡| 观看免费一级毛片| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 18+在线观看网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| a级一级毛片免费在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 色吧在线观看| 亚洲在线自拍视频| 天堂√8在线中文| 十八禁国产超污无遮挡网站| 99热只有精品国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久精品国产清高在天天线| 国产高清三级在线| 国产成人精品婷婷| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品三级大全| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产视频首页在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲最大成人av| 人人妻人人看人人澡| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av一区综合| 色5月婷婷丁香| av在线天堂中文字幕| kizo精华| 日本免费a在线| 亚洲无线观看免费| 午夜亚洲福利在线播放| 大香蕉久久网| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久九九精品影院| av在线蜜桃| 久久久久网色| 日韩精品青青久久久久久| 美女 人体艺术 gogo| 国产三级中文精品| 少妇熟女欧美另类| 亚洲自拍偷在线| 女人被狂操c到高潮| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲一区高清亚洲精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲第一电影网av| 日韩三级伦理在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 少妇的逼好多水| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产探花极品一区二区| 嫩草影院入口| 欧美三级亚洲精品| 精品人妻熟女av久视频| av天堂在线播放| 色视频www国产| 深夜a级毛片| 免费看日本二区| 国产不卡一卡二| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费av毛片视频| 观看免费一级毛片| 精品久久久久久久久av| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 婷婷亚洲欧美| 插阴视频在线观看视频| 欧美精品一区二区大全| 桃色一区二区三区在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 国产在视频线在精品| 久久99热这里只有精品18| 级片在线观看| 亚洲内射少妇av| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美日韩乱码在线| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜福利在线观看吧| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 日本一本二区三区精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产黄色小视频在线观看| 国产精品国产高清国产av| 好男人视频免费观看在线| 国产黄片美女视频| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩精品青青久久久久久| 成年免费大片在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品午夜福利在线看| 欧美激情国产日韩精品一区| 毛片一级片免费看久久久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久国产成人免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩视频在线欧美| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲最大成人中文| 天天躁日日操中文字幕| 天堂中文最新版在线下载 | 成人亚洲欧美一区二区av| 性色avwww在线观看| av在线蜜桃| 久久人人爽人人片av| 精品人妻视频免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 国产私拍福利视频在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 我要搜黄色片| 亚洲精品456在线播放app| 欧美激情国产日韩精品一区| 婷婷六月久久综合丁香| 嘟嘟电影网在线观看| 国产高清激情床上av| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久99热这里只有精品18| 精品久久久噜噜| 亚洲无线在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 嫩草影院入口| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 男女那种视频在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲av男天堂| 国产久久久一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 老司机影院成人| 国产熟女欧美一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美人与善性xxx| a级毛片a级免费在线| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| av黄色大香蕉| 少妇丰满av| 国产91av在线免费观看| 国产一区二区在线观看日韩| 久久草成人影院| 村上凉子中文字幕在线| 午夜激情福利司机影院| 精品人妻偷拍中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲色图av天堂| 69av精品久久久久久| 国产黄片美女视频| 国模一区二区三区四区视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久韩国三级中文字幕| 国产免费男女视频| av视频在线观看入口| 亚洲欧美日韩东京热| 中国国产av一级| 欧美日本视频| 舔av片在线| 欧美日本视频| 亚洲欧洲日产国产| 啦啦啦观看免费观看视频高清| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品人妻久久久影院| 99久久人妻综合| 草草在线视频免费看| 国产91av在线免费观看| 国产高清激情床上av| 内地一区二区视频在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 免费电影在线观看免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产色爽女视频免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 国产乱人偷精品视频| 国产一区二区在线观看日韩| 99久久人妻综合| 99久久精品热视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久99热这里只有精品18| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 高清毛片免费观看视频网站| 国产熟女欧美一区二区| 日本一二三区视频观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲成人久久爱视频| 大型黄色视频在线免费观看| 韩国av在线不卡| 日本五十路高清| 久久精品久久久久久久性| 国产精品无大码| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费观看a级毛片全部| 干丝袜人妻中文字幕| 日本五十路高清| 干丝袜人妻中文字幕| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本免费a在线| 国产探花极品一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 国产高清有码在线观看视频| 内射极品少妇av片p| 成人漫画全彩无遮挡| a级一级毛片免费在线观看| 少妇的逼好多水| 亚洲在线观看片| 色吧在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产一区二区在线观看日韩| 如何舔出高潮| 草草在线视频免费看| 99久久成人亚洲精品观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久久成人免费电影| 99久久人妻综合| 亚洲18禁久久av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜激情欧美在线| 久久久久久伊人网av| 日韩成人伦理影院| 在现免费观看毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 啦啦啦韩国在线观看视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产高清三级在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产乱人视频| 老女人水多毛片| 狠狠狠狠99中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 老女人水多毛片| 亚洲七黄色美女视频| 中文字幕av成人在线电影| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲成人久久性| 久久久久久久久久久丰满| 久久综合国产亚洲精品| 国产高潮美女av| 99久久成人亚洲精品观看| 一个人免费在线观看电影| ponron亚洲| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产爱豆传媒在线观看| 又爽又黄a免费视频| 精品免费久久久久久久清纯| 国产乱人视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 欧美zozozo另类| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩视频在线欧美| 久久午夜福利片| 久久国产乱子免费精品| 国产在线男女| 国内精品宾馆在线| 一区福利在线观看| 国产亚洲精品av在线| 精品一区二区三区视频在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 欧美变态另类bdsm刘玥|