基于RNA-Seq對(duì)心肌肌鈣蛋白IR193H突變限制性心肌病小鼠轉(zhuǎn)錄組的分析

干意，封葉，趙唯安，劉振國(guó)，張蕾，田杰

限制性心肌病(restrictive cardiomyopathy，RCM)是兒童心肌病的一種類(lèi)型，占小兒心肌病的2%～5%[1]，是一種由于心肌僵硬度升高導(dǎo)致以舒張功能?chē)?yán)重受損為主要特征的心肌病，表現(xiàn)為心室舒張末容積正?；蚩s小，心室壁厚度正常或輕度增加，而收縮功能大多正常或僅有輕度受損[2-3]。兒童RCM多為特發(fā)性，病因不明，約30%病例有家族發(fā)病傾向，多為常染色體顯性遺傳。已有研究發(fā)現(xiàn)心肌肌小節(jié)蛋白、結(jié)蛋白、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、β-肌球蛋白重鏈等基因突變與RCM有關(guān)[4]，其中，cTnI作為重要的心肌結(jié)構(gòu)蛋白，其突變與原發(fā)性心肌病關(guān)系尤為密切[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，6種類(lèi)型的cTnI突變可導(dǎo)致RCM(L144Q、R145W、A171T、K178E、D190G、R192H)，其中兩種類(lèi)型的突變(K178E、R192H)臨床癥狀最為嚴(yán)重[7]。本課題組擁有黃旭培教授成功構(gòu)建的來(lái)源于人cTnI基因突變的RCM小鼠動(dòng)物模型(在小鼠系193位點(diǎn)，cTnI R193H)，該模型小鼠與攜帶該突變的RCM患者(在人192位點(diǎn)，cTnI R192H)有相似的病理改變、癥狀和表型[8-9]，其在6～8周時(shí)，超聲即可檢測(cè)到舒張功能的改變[10]，但具體致病機(jī)制尚不明確。本研究利用高通量測(cè)序的方法，分析RCM小鼠與正常小鼠差異表達(dá)的基因，篩選出可能參與致病過(guò)程的分子及信號(hào)通路，為RCM發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 R193H(美國(guó)佛羅里達(dá)大西洋大學(xué)黃旭培教授贈(zèng)送)C57和野生型(WT)C57 3月齡小鼠(購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院SPF動(dòng)物中心)，RNA提取試劑盒(BioTeke，北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)，SYBR Green試劑盒(KAPA，美國(guó))。實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備由重慶醫(yī)科大學(xué)兒研所提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合倫理要求，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 小鼠心臟組織總RNA提取 準(zhǔn)備3月齡R193H和WT小鼠，利用CO2麻醉處死后，剪開(kāi)小鼠胸腔，灌洗心臟，取心臟組織，利用高純度總RNA快速提取試劑盒提取心臟組織總RNA?？俁NA樣本質(zhì)量由上海裂冰生物醫(yī)藥有限公司采用Agilent2200儀器進(jìn)行檢測(cè)。RNA分子完整數(shù)(RNA integrity number，RIN)＞8.0的RNA用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建。樣本和RNA均放入–80℃冰箱保存。

1.3 基于RNA-Seq技術(shù)的差異表達(dá)基因篩選基因的表達(dá)量計(jì)算主要采用RPKM方法(Reads per kb per million reads)，計(jì)算公式為：RPKM=106C/(NL/103)。其中RPKM為基因表達(dá)量，C為唯一比對(duì)到該基因上讀段(reads)數(shù)，N為唯一比對(duì)到參考基因上的總讀段數(shù)，L為該基因編碼區(qū)的堿基數(shù)。RPKM法消除了基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異[11]。采用國(guó)際公認(rèn)算法EBSeq軟件包對(duì)表達(dá)量(Counts)進(jìn)行差異篩選。以差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥1.2或≤0.833、P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因，其中錯(cuò)誤檢出率(false discovery rate，F(xiàn)DR)＜0.05。利用Cluster軟件，以歐氏距離為距離距陣計(jì)算公式，對(duì)差異表達(dá)基因和樣本同時(shí)進(jìn)行分層聚類(lèi)分析，聚類(lèi)結(jié)果用Java Treeview 1.1.6 R2軟件顯示。

1.4 基因功能分析 將分析得到的差異基因基于數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt(http://www.uniprot.org/)、GOC(http://www.geneontology.org/)，分別從生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(celluar components，CC)、分子功能(molecular function，MF)這三個(gè)層面進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)注釋?zhuān)玫交騾⑴c的所有GO，采用Fisher檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)GO的顯著性水平(P值)，從而篩選出差異基因富集的顯著性GO。其中，P＜0.05的值用灰白相間的表格標(biāo)出。

1.5 功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于GO的層次結(jié)構(gòu)，利用NovelBio云計(jì)算平臺(tái)將所有GO之間的相互調(diào)控及從屬關(guān)系整理成數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建功能關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，總結(jié)實(shí)驗(yàn)影響的功能群體，以及顯著性功能的內(nèi)在從屬關(guān)系。以差異基因所做GO分析中的顯著性GO條目(P＜0.05)為研究對(duì)象進(jìn)行功能調(diào)控分析，構(gòu)建功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 信號(hào)通路分析(pathway-analysis) 將篩選出的差異基因于KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋?zhuān)玫讲町惢騾⑴c的所有通路條目，采用Fisher檢驗(yàn)計(jì)算通路的顯著性水平(P值)，從而篩選出差異基因富集的顯著性通路條目。P＜0.05的值用灰白相間的表格標(biāo)出。

1.7 信號(hào)通路相互作用關(guān)系分析 選用顯著性通路，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中通路之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系整合成顯著性通路之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。在此以差異基因所做的通路分析中的顯著性通路條目(P＜0.05)進(jìn)行信號(hào)通路相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.8 引物的設(shè)計(jì)和合成 在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中檢索Tifab、Ifi202b、Ctss、Itgb2、Pik3ap1、Arhgap21、Myocd、MT-ND5基因的mRNA序列。采用Primer Premier 5.0軟件針對(duì)這些基因CDS核心編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，引物的堿基序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為：Tifab，正向5'-GCTGCCACAGTTGTCTCGCTAC-3'，反向5'-ATG CCAGAGAAGGAGATTCTGTTGATG-3'；Ifi202b，正向5'-ACTGACCAGTGTCAACTGTGAGATTG-3'，反向5'-TGACCTCCATGTAACTGTACCTCGTAG-3'；Ctss，正向5'-GCCAGCCAヰCCTCCヰCヰCヰC-3'，反向5'-TCTTGCCATCCGAATGTATCCTTGATC-3'；Itgb2，正向5'-GCAGCAGAAGGACGGAAGGAA C-3'，反向5'-ATGACCAGGAGGAGGACACCAATC-3'；Pik3ap1，正向5'-GCAGCCAACCCAGTACAGTT-3'，反向5'-GGGACAAATCCAGCCATAGA-3'；Arhgap21，正向5'-GAGAGCAGACAACGCCATCAGAAG-3'，反向5'-TCCGCCTCTTGGTCTCACTGTAC-3'；Myocd，正向5'-CTGCCAGACACCヰCACCGATG-3'，反向5'-CCACCAGCATCTTGTCCTTCTCAG-3'；MT-ND5，正向5'-CCTGGCAGACGAACAAGACATC C-3'，反向5'-CGAGGCヰCCGAヰACTAGGCATG-3'。

1.9 Q-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量 為驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果的可靠性，隨機(jī)選擇8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)，分別從R193H和WT小鼠中提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用SYBR Green試劑盒(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行Real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))測(cè)量吸光度，mRNA相對(duì)表達(dá)量分析采用2–ΔΔCt法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)并制圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 對(duì)R193H和WT兩組共6個(gè)樣本(生物學(xué)重復(fù)3個(gè))進(jìn)行分析，得出差異表達(dá)的基因共52個(gè)(表1)，其中28個(gè)基因上調(diào)，24個(gè)基因下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因和樣本同時(shí)進(jìn)行分層聚類(lèi)分析(圖1)，可見(jiàn)表達(dá)模式相似的基因具有功能相關(guān)性。根據(jù)差異表達(dá)的基因構(gòu)建火山圖，對(duì)樣本之間和基因之間的差異進(jìn)行直觀(guān)展示(圖2)。

表1 RNA-Seq分析野生型和突變型R193H小鼠差異表達(dá)基因Tab.1 Analysis of the differentially expressed genes of wild type and mutant R193H mice by RNA-Seq

圖1 R193H與WT基因差異表達(dá)模式聚類(lèi)圖Fig.1 Clustering diagram of R193H vs. WT gene expression pattern

圖2 R193H與WT基因差異表達(dá)火山圖Fig.2 R193H vs. WT genetic differentially expressed volcanic maps

2.2 利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行的基因功能分析從BP、CC、MF這3個(gè)層面進(jìn)行GO注釋(圖3)，基于通路的分析進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能。將差異基因進(jìn)行GO顯著性富集(圖4)，差異表達(dá)基因在生物過(guò)程分組中主要富集在翻譯延伸(translational elongation)、固有免疫應(yīng)答(innate immune response)、ATP合成耦合電子傳輸(ATP synthesis coupled electron transport)這三個(gè)生物學(xué)過(guò)程中，涉及轉(zhuǎn)錄翻譯、免疫以及能量代謝相關(guān)基因。層次樹(shù)狀圖顯示出顯著性功能的內(nèi)在從屬關(guān)系(圖5)。

圖3 GO功能分類(lèi)Fig.3 GO function classification

圖4 KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.4 KEGG enriched scatter plot

圖5 顯著性功能間的層次樹(shù)形關(guān)系圖Fig.5 The hierarchical tree diagram for significant functions

2.3 顯著性差異基因的KEGG分析 根據(jù)差異表達(dá)的KEGG功能注釋結(jié)果進(jìn)行通路顯著性富集分析(圖6)，共得到16條顯著富集的通路，涉及了氨?；?tRNA生物合成通路(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、NF-κB信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。對(duì)顯著性差異的通路條目進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，可以直觀(guān)顯示顯著性功能之間的關(guān)系(圖7)。

圖6 顯著通路富集度柱狀圖Fig.6 Significant pathway enrichment histogram

圖7 顯著性功能間的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建關(guān)系圖Fig.7 Network construction diagram of significant functions

2.4 差異表達(dá)基因驗(yàn)證 隨機(jī)選取8個(gè)差異表達(dá)的基因，每組取4個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，分別為T(mén)ifab、Ifi202b、Ctss、Itgb2、Pik3ap1、Arhgap21、Myocd、MT-ND5。結(jié)果顯示，突變組Tifab、Ifi202b、Ctss、Itgb2、Pik3ap1基因mRNA表達(dá)量與WT組比較明顯升高，Arhgap21、Myocd、MT-ND5基因mRNA表達(dá)量與WT組比較明顯降低(P＜0.05)，該結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致(圖8)。

圖8 野生型和突變型相關(guān)基因的mRNA水平Fig.8 mRNA levels of wild-type and mutant

3 討 論

目前研究認(rèn)為，RCM可能是特發(fā)性的、家族性的或繼發(fā)于其他條件發(fā)生的疾病[12]。最新分子遺傳技術(shù)的進(jìn)展明顯加深了對(duì)該疾病的理解[5]，在編碼肌節(jié)蛋白的相關(guān)基因中已經(jīng)鑒定了幾個(gè)RCM特異性突變，其中cTnI作為重要的心肌結(jié)構(gòu)蛋白，其突變可以導(dǎo)致RCM和家族性肥厚性心肌病[13]。本課題組擁有來(lái)源于人cTnI基因192位點(diǎn)突變的RCM小鼠動(dòng)物模型(在小鼠系193位點(diǎn)，cTnI R193H)，模型小鼠與攜帶該突變的RCM患者有相似的病理改變、癥狀和表型[10,14]，從而驗(yàn)證了cTnI突變與RCM的關(guān)系。目前，RCM相關(guān)機(jī)制的研究頗多。有研究表明，cTnI突變可能引起心肌細(xì)胞鈣敏性改變而導(dǎo)致RCM[15]，也有學(xué)者認(rèn)為cTnI突變可能導(dǎo)致與其相互作用的基因或蛋白發(fā)生改變，從而導(dǎo)致心臟功能的改變[16]，但cTnI突變引起RCM的機(jī)制尚不明確。

轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合。RNA-Seq利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)組織或細(xì)胞中所有RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)統(tǒng)計(jì)相關(guān)reads數(shù)計(jì)算出不同RNA的表達(dá)量[17]，尋找出兩組樣本中差異表達(dá)的基因[18]。這種方法改變了轉(zhuǎn)錄序列的研究方式，主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究。本課題組利用RNA-Seq技術(shù)探究cTnI在RCM發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)作用[19]。通過(guò)檢測(cè)cTnI突變導(dǎo)致的RCM模型鼠和同月齡WT小鼠基因表達(dá)譜的差異，找出52個(gè)差異表達(dá)基因，隨機(jī)挑選出8個(gè)差異表達(dá)基因利用Q-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)果初步驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)和下調(diào)的基因在細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程三個(gè)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中上調(diào)的基因及產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞表面和質(zhì)膜外側(cè)面，分子水平主要是具有結(jié)合活性，多參與到固有免疫應(yīng)答的過(guò)程，涉及的基因有Cxcr3、Fcgr1、Icam1、Clec12a、Ctss、Lbp等。而下調(diào)的基因及產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞骨架和線(xiàn)粒體中，分子功能主要是催化活性，參與的生物學(xué)過(guò)程主要是翻譯延長(zhǎng)和ATP合成耦聯(lián)電子運(yùn)輸，涉及的基因有D2hgdh、ND5、Myom1、Ubr4、Spta1、Lrpprc、Arhgap21。這一結(jié)果表明，cTnI突變可能伴隨免疫相關(guān)分子的上調(diào)和能量代謝的抑制。通過(guò)通路顯著性富集分析，共得到16條顯著富集的通路，涉及氨?；?tRNA生物合成、NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路。但是由于差異基因的數(shù)量并不大，通路分析的結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究后續(xù)重點(diǎn)分析了差異基因參與的生物學(xué)進(jìn)程及參與的信號(hào)通路。通過(guò)分析該測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的基因主要參與免疫應(yīng)答、線(xiàn)粒體能量代謝、心肌細(xì)胞分化等過(guò)程，如Ifi202b、ND5、Itgb2、Myocd等基因。既往研究表明，cTnI某些序列是免疫調(diào)節(jié)序列，能通過(guò)免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌疾病[20]，而本研究結(jié)果顯示，在cTnI突變所致的RCM動(dòng)物模型中參與免疫應(yīng)答的一系列基因表達(dá)量發(fā)生改變，提示免疫功能的改變可能在RCM的發(fā)病中具有重要作用。另有研究表明，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和結(jié)合蛋白之間復(fù)雜的相互作用，調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的代謝活性，從而導(dǎo)致能量代謝受損可能是RCM發(fā)生的潛在機(jī)制[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體能量代謝相關(guān)基因差異表達(dá)顯著，提示在RCM發(fā)病中cTnI突變可能伴隨著能量代謝改變。NADH泛醌氧化還原酶亞基5(ND5或MT-ND5，EC 1.6.5.3)由位于線(xiàn)粒體DNA的鳥(niǎo)嘌呤富集重鏈中的最大基因編碼(mtDNA坐標(biāo)：12337-14148)，參與的相關(guān)途徑包括呼吸電子傳遞，通過(guò)化學(xué)滲透耦合進(jìn)行ATP合成，以及通過(guò)解耦聯(lián)蛋白產(chǎn)生熱量，該基因的表達(dá)降低可能與線(xiàn)粒體能量代謝受損相關(guān)[22]，但其具體內(nèi)在機(jī)制尚需深入研究。差異表達(dá)的基因中也發(fā)現(xiàn)有PI3KAP1基因，結(jié)合課題組前期研究證實(shí)cTnI與多種PI3K-Akt信號(hào)通路中的蛋白相結(jié)合[23]，表明PI3K-Akt信號(hào)通路可能通過(guò)cTnI參與RCM的發(fā)生。

綜上所述，利用測(cè)序技術(shù)和特有的RCM模型，本研究初步篩選出了可能參與RCM發(fā)病機(jī)制的基因及其相關(guān)通路，可以通過(guò)尋找對(duì)差異表達(dá)基因有調(diào)控作用的藥物，提高對(duì)該疾病的治療效果。cTnI作為一種重要的心肌蛋白，作用機(jī)制十分復(fù)雜，其功能仍需進(jìn)一步深入研究。