Alpha-熊果苷激活凋亡信號通路對人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞TIB-152異常增殖的調(diào)節(jié)作用①

字友梅 黃 琰 郭 燕 張 媛 王莉華 呂國慶 吳 隼

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液一病區(qū)，衛(wèi)輝453100)

白血病是一類骨髓中造血干細(xì)胞克隆增殖性疾病，常會出現(xiàn)細(xì)胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等。白血病包括四種亞型：急性淋巴細(xì)胞性、急性髓細(xì)胞性、慢性淋巴細(xì)胞性和慢性骨髓性[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年全世界白血病新增病例35.2萬，占所有癌癥病例的2.5%，居第11位；死亡病例26.5萬，占所有癌癥死亡病例的3.2%，居第10位[2]。白血病是中國十大癌癥之一，2012年白血病死亡病例5.2萬，占全球白血病死亡病例的19.7%[3]。白血病的治療是一個亟待解決的重要醫(yī)學(xué)問題。研究表明許多草藥及植物果實(shí)有利于白血病的治療[4]。熊果苷(對-羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)是一種天然的多酚類物質(zhì)，屬于氫醌葡萄糖苷化合物，具有2種異構(gòu)體即alpha-熊果苷和beta-熊果苷，首先發(fā)現(xiàn)于熊果干燥的葉子中，是常見的黑色素合成抑制劑，在化妝品行業(yè)被廣泛用作美白成分[5]。除此之外熊果苷還有許多其他的功能，例如殺菌，抗炎等[6]。但alpha-熊果苷在白血病中的作用研究還很缺乏。本研究的主要目的是探究alpha-熊果苷對人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞TIB-152增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系與主要試劑 急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系TIB-152購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。Alpha-熊果苷(分析純)購自Sigma公司。培養(yǎng)基RPMI1640和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。CCK-8試劑盒來源于日本同仁化學(xué)公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司?？笲細(xì)胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl 2)抗體，抗Bcl 2相關(guān)蛋白X (Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體，抗 Cleaved caspase-3抗體和抗Cleaved caspase-9抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 TIB-152細(xì)胞于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時進(jìn)行傳代。用不同濃度(0、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的alpha-熊果苷處理TIB-152細(xì)胞48 h后通過CCK-8檢測細(xì)胞毒性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)TIB-152細(xì)胞分為4組：TIB-152 (對照組)；alpha-熊果苷(10、20、50 μmol/L)組。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞增殖 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細(xì)胞后，每天檢測各組細(xì)胞的增殖倍數(shù)。首先用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液制成1×106個/ml的細(xì)胞懸液；然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，最后檢測450 nm處吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細(xì)胞48 h后檢測細(xì)胞凋亡率。首先1×的Binding buffer將待測細(xì)胞制成1×106個/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細(xì)胞儀對染色的細(xì)胞進(jìn)行檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4蛋白印跡 在10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細(xì)胞48 h后，首先用PBS將待測細(xì)胞清洗3次，再入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后用5%的BSA封閉1 h，再加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，第2天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Alpha-熊果苷對TIB-152的細(xì)胞毒性檢測 通過CCK-8檢測不同濃度alpha-熊果苷處理TIB-152后的細(xì)胞活力，分析alpha-熊果苷對TIB-152的細(xì)胞毒性。圖1B顯示，當(dāng)alpha-熊果苷處理濃度<50 μmol/L 時，TIB-152的細(xì)胞活力可維持在80%以上，未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性；但當(dāng)alpha-熊果苷處理濃度>50 μmol/L時，TIB-152的細(xì)胞活力急劇下降，均在80%以下。由此可見，<50 μmol/L的alpha-熊果苷對TIB-152沒有明顯的細(xì)胞毒性，>50 μmol/L的alpha-熊果苷會對TIB-152產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

2.2Alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞增殖的影響 為分析alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞增殖的影響，利用CCK-8檢測細(xì)胞增殖倍數(shù)。如圖2所示，10 μmol/L的alpha-熊果苷組與對照組細(xì)胞增殖倍數(shù)無明顯變化。與對照組相比，50 μmol/L的alpha-熊果苷組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯降低(P<0.01)。以上結(jié)果說明，alpha-熊果苷可減弱TIB-152細(xì)胞增殖。

圖1 Alpha-熊果苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式(A)和alpha-熊果苷對TIB-152 (B)和正常的PBMC (C)細(xì)胞活力的影響Fig.1 Chemical structure of alpha-Arbutin (A) and effect of alpha-Arbutin on cell viability of TIB-152 (B)and normal PBMC cells (C)

圖2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖Fig.2 Proliferation was detected by CCK-8Note: **.P<0.01 vs.control group.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram of flow cytometry，**.P<0.01 vs.control group.

圖4 蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2表達(dá)Fig.4 Expression of Bax and Bcl-2 was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs control group.

圖5 蛋白印跡檢測Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)Fig.5 Expression of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 was measured by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs.control group.

2.3Alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞凋亡的影響 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，分析alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞凋亡的影響。由圖3可知，50 μmol/L的alpha-熊果苷組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)。上述結(jié)果表明，alpha-熊果苷可增強(qiáng)TIB-152細(xì)胞凋亡。

2.4Alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞Bax/Bcl-2 表達(dá)的影響 利用蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2表達(dá)，分析alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞Bax/Bcl-2 蛋白比值的影響。圖4顯示，50 μmol/L的alpha-熊果苷組Bax/Bcl-2比值顯著高于對照組(P<0.01)。由此可見，alpha-熊果苷可提高TIB-152細(xì)胞Bax/Bcl-2 蛋白比值。

2.5Alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)的影響 通過蛋白印跡分析alpha-熊果苷對TIB-152細(xì)胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)的影響。如圖5所示，50 μmol/L的alpha-熊果苷組Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01)。以上結(jié)果說明，alpha-熊果苷可上調(diào)TIB-152細(xì)胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)。

3 討論

目前對T細(xì)胞白血病的主要治療方法包括：化療、造血干細(xì)胞移植、免疫療法、分子靶向治療等[7]。但這些方法都存在一些缺陷，挖掘新的白血病治療藥物具有重要意義。大量文獻(xiàn)報道植物提取物在各類疾病治療中具有積極作用[8-10]。

細(xì)胞增殖的不受控是癌細(xì)胞的普遍特征。研究表明許多植物提取物都可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖。有數(shù)據(jù)顯示梓醇(一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷化合物)具有抑制卵巢癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞增殖的功效[11,12]。有研究發(fā)現(xiàn)在白血病HL60細(xì)胞中，沙棘提取物可抑制細(xì)胞增殖[13]。據(jù)報道肉桂葉提取物可減弱白血病細(xì)胞THP-1增殖[14]。熊果苷是目前美白化妝品的主要原料，質(zhì)量濃度一般在0.07～50 mg/L。近年來還發(fā)現(xiàn)熊果苷對癌癥的治療也具有積極作用。有數(shù)據(jù)表明熊果苷可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖[15]。本文結(jié)果顯示，alpha-熊果苷可明顯減弱人急性T細(xì)胞白血病TIB-152細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡的受阻是癌癥的主要特征之一。越來越多的研究表明植物提取物在抗癌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著積極作用。有數(shù)據(jù)顯示大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可提高卵巢癌細(xì)胞凋亡[16]。Jin等[17]發(fā)現(xiàn)梓醇可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡。據(jù)報道TIB-152細(xì)胞中，百足草提取物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。有研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物可誘導(dǎo)白血病HL60細(xì)胞凋亡[19]。據(jù)報道熊果苷可促進(jìn)B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，alpha-熊果苷可增強(qiáng)TIB-152細(xì)胞凋亡。但有研究顯示熊果苷有保護(hù)U937淋巴瘤細(xì)胞免于電離輻射誘導(dǎo)的凋亡的作用[21]。這可能是由于熊果苷存在2種同分異構(gòu)體：α型和β型，這2種同分異構(gòu)體的不僅在物理化學(xué)性質(zhì)方面存在一定的差異，在功能方面也存在差異[22-24]。另一方面可能是由于作用的時間、濃度、細(xì)胞系及細(xì)胞所處的環(huán)境的不同造成的。

在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路中Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3都是關(guān)鍵性因子[25]。許多植物提取物可影響這些細(xì)胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)黃柏酮葡萄糖苷及槲皮素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷均可提高前列腺癌細(xì)胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強(qiáng)Caspase-3表達(dá)[26,27]。據(jù)報道茯苓提取物可提高白血病U937細(xì)胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上調(diào)Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表達(dá)[28]。Sung等[29]發(fā)現(xiàn)緊密小鷹芹提取物可提高白血病HL60細(xì)胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強(qiáng)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)。本文結(jié)果顯示，alpha-熊果苷可提高TIB-152細(xì)胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上調(diào)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)。

本研究表明，在人急性T細(xì)胞白血病TIB-152細(xì)胞中，alpha-熊果苷可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強(qiáng)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達(dá)。綜上所述，alpha-熊果苷可激活凋亡信號通路抑制人急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞TIB-152細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。下一步計(jì)劃進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究alpha-熊果苷對急性T細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展的影響。