PinX1過表達對人卵巢癌細胞SKOV3增殖及侵襲的影響

朱 靜 楊 鷹

(陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院婦產科，重慶400037)

卵巢癌是嚴重威脅女性身心健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位，而其致死率卻位列首位[1]。近年來，臨床上卵巢癌的治療雖然在傳統(tǒng)手術、化療及放療技術上有所改進，但晚期患者的5年生存率仍不容樂觀，其主要原因是由于卵巢癌早期癥狀不明顯，患者就診時已至進展期，延誤了最佳診治時機[2]。因此，尋找新的、有效的卵巢癌分子標志物，對提高卵巢癌早期篩查與診斷具有重要意義。

人 Pin2 結合蛋白 X1 ( PIN2-interacting protein X1，PinX1)定位于人染色體8p23，是端粒和端粒酶的調控基因[3]。近年來研究顯示，PinX1是一種潛在的抑癌基因，其表達水平的改變可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在包括膀胱癌、食管癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實體瘤中表達明顯降低或不表達[4-7]。過表達PinX1可明顯抑制腫瘤細胞的生長、降低裸鼠體內的成瘤性[8,9]。然而PinX1在卵巢癌細胞中的研究較少，PinX1 在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展進程中是否發(fā)揮著同樣的重要作用目前尚不清楚。為此，本研究分別在 mRNA 及蛋白水平上檢測了PinX1 在人卵巢癌細胞中的表達，并通過構建PinX1過表達重組載體，進一步探討過表達PinX1對卵巢癌細胞SKOV3增殖及遷移的影響，旨在初步闡明PinX1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，為尋找卵巢癌有效的診斷及預后靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑 蛋白質提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人PinX1單克隆抗體、兔抗人c-myc單克隆抗體均購自美國Abcam公司，兔抗人MMP2單克隆抗體購自美國CST公司，GAPDH 抗體購自美國Sigma 公司，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen 公司，總RNA 提取試劑盒購自美國OmegaBio-Tek公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人卵巢癌細胞(Caov3、OVCAR3、A2780、SKOV3)及人正常卵巢上皮細胞株IOSE80由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院中心實驗室儲存。細胞經復蘇后培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。

1.2.2PinX1真核過表達載體的構建與轉染 根據PinX1基因在Genebank中的cDNA序列(NO:NM_017884.5) 設計上下游引物，并由上海生工合成，同時提取卵巢癌細胞SKOV3 總RNA，逆轉錄獲得cDNA，以其為模板，進行PCR擴增并膠回收，按照pCMV-N-Flag操作手冊構建重組載體，酶切鑒定并測序。

將SKOV3細胞以 2×105個/孔接種于 6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，當細胞達80%～90% 融合時，參照 Lipofectamine 2000產品說明書，分別將pCMV-N-Flag-PinX1和空載體轉染至6孔培養(yǎng)板中，4 h后更換新鮮培養(yǎng)基。實驗分組為：vector組(轉染空載體)，PinX1組(轉染pCMV-N-Flag-PinX1重組載體)。

1.2.3Real-time PCR 按照RNA 提取試劑盒說明書提取已收集的各組細胞總 RNA。采用SYBR Green 法 進 行Real-time PCR，用于擴增PinX1 cDNA的上游引物為:5′-GGGTGGTCTAAAGGA-AAGGGTT-3′,下游引物:5′-CGCCCTCGGGAGTCTT-CTTAC-3′;GAPDH上游引物:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引 物:5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′,反應條件為:94℃ 2 min預變性;94℃ 30 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共 35 個循環(huán)，采用 2-ΔΔCT法計算并分析實驗結果。

1.2.4Western blot 收集各組細胞，加入990 μl細胞裂解液及10 μl PMSF提取細胞總蛋白，采用BSA 法測定蛋白濃度，按1∶4加入適量上樣緩沖液于100℃煮沸5 min變性;每孔 40 μg，采用80 V恒壓、10%分離膠 SDS-PAGE 進行電泳，100 V 100 min 恒壓將蛋白印跡電轉至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗( PinX1 1∶1 000、 c-myc 1∶500、MMP2 1∶1 000) 4℃ 孵育過夜，次日 TBST 漂洗 5 min×5次，加入 HRP 標記的二抗(1∶3 000) 室溫孵育40 h，TBST 漂洗5 min×5次，ECL化學發(fā)光顯影，使用 Quantity One 軟件分析并統(tǒng)計數據。

1.2.5CCK-8增殖實驗 以2×103個/孔將已轉染24 h 的細胞接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后記為 0 h，分別在 24、48、72、96 h 時間點，加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育1.5 h，檢測 450 nm 處光密度值。

1.2.6Transwell 侵襲實驗 Transwell 小室上室加入60 μl Matrigel，下室中加入含15%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液，收集已轉染24 h的各組細胞，計數，并以2×104個/孔接種入小室，37℃過夜培養(yǎng)24 h 后取出上室，4%多聚甲醛固定、結晶紫染色，觀察并計數。

2 結果

2.1Real-time PCR、Western blot檢測PinX1在卵巢癌細胞系及正常卵巢上皮細胞系中的表達 結果顯示，人卵巢癌細胞OVCAR-3、A2780、SKOV3、Caov3中PinX1 mRNA、蛋白表達水平(依次為0.203±0.099、0.381±0.087、0.172±0.121、0.292±0.069)明顯低于人正常卵巢上皮細胞IOSE80(0.69±0.156)，尤其在 SKOV3 細胞中表達最低(圖1)。

圖1 Real-time PCR、Western blot檢測不同卵巢癌細胞系及正常卵巢上皮細胞系中PinX1的表達水平Fig.1 Expression of PinX1 level was detected by Real-time PCR and Western blot in four ovarian cancer cells and a normal ovarian epithelial cellsNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05 vs IOSE80 cells,n=3.

圖2 Real-time PCR、Western blot 分別在mRNA與蛋白水平檢測 PinX1過表達效率Fig.2 Expression of PinX1 mRNA and protein levels was detected by Real-time PCR and Western blot,respectivelyNote: A.mRNA level；B.Protein level.*.P<0.05 vs vector group,n=3.

圖3 CCK-8 檢測過表達PinX1 基因對SKOV3 細胞增殖的影響Fig.3 SKOV3 cells were transfected with vector or pCMV-N-Flag-PinX1 plasmid and cell proliferation was evaluated by CCK-8 assayNote: **.P<0.01,vs vector group,n=3.

2.2Real-time PCR、Western blot 驗證PinX1 過表達效率 結果顯示，PinX1組中PinX1基因的相對表達量明顯高于對照組，對照組中PinX1蛋白表達為0.181±0.109，過表達組為0.892±0.094，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2,P<0.05)，提示PinX1 基因被有效過表達。

2.3過表達PinX1對人卵巢癌SKOV3 細胞增殖能力的影響 采用 CCK-8 法檢測細胞貼壁后24、48、72、96 h的光密度值并繪制生長曲線，結果顯示與vector組相比，PinX1組中細胞生長速率明顯下降，提示過表達 PinX1對SKOV3細胞生長存在抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(圖 3，P<0.01)。

2.4過表達PinX1對人卵巢癌SKOV3 細胞侵襲能力的影響 Transwell實驗結果顯示，PinX1組中細胞量較對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(圖 4，P<0.05)，提示過表達PinX1可抑制 SKOV3 細胞侵襲能力。

2.5過表達PinX1對卵巢癌 SKOV3 細胞c-myc，MMP2 表達的影響 結果顯示， 對照組與過表達組中c-myc蛋白表達分別為0.871±0.09、0.435±0.141，MMP2蛋白表達分別為0.622±0.11、0.312±0.08，PinX1組中c-myc、MMP2表達水平明顯低于vector 組(圖 5)，提示過表達PinX1能抑制 c-myc 和MMP2的表達。

圖4 過表達PinX1對SKOV3 細胞侵襲能力的影響Fig.4 Results of Transwell Matrigel invasion assay of SKOV3 cells with PinX1 up-regulationNote: **.P<0.01 vs vector group,n=3.

圖5 過表達PinX1對c-myc、MMP2表達的影響Fig.5 Expression of MMP2 and c-myc detected by Real-time PCR and Western blotNote: A.c-myc expression；B. MMP2 expression；*.P<0.01 vs vector group,n=3.

3 討論

癌基因的激活、抑癌基因的失活以及它們彼此相互作用的失衡是腫瘤形成的主要原因，因而，探索與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關重要基因及其所介導的信號通路將有助于揭示卵巢癌的發(fā)病機制，為卵巢癌的診療提供重要的分子生物學依據。

前期研究顯示，與正常卵巢上皮組織相比PinX1在卵巢癌組織中明顯低表達，且與腫瘤的淋巴結轉移、FIGO分期密切相關[10]，然而其具體的分子作用機制卻鮮為人知。為此，本研究首先分析了PinX1在人正常卵巢上皮細胞和不同卵巢癌細胞中的表達，Real-time PCR、Western blot結果顯示 PinX1在卵巢癌細胞中表達明顯降低，提示其可能作為抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與先前在臨床組織的研究結果一致。為了進一步探討其對卵巢癌細胞生物學行為的影響及其相關分子機制，本研究通過構建pCMV-N-Flag-PinX1過表達重組載體，采用脂質體瞬時轉染入人卵巢癌細胞SKOV3中，并分別在mRNA 和蛋白水平檢測PinX1在細胞中的表達變化，結果顯示PinX1表達水平顯著上調，提示PinX1基因被有效過表達，而穩(wěn)定過表達PinX1載體的成功構建可能為基因的靶向治療提供有力的工具。此外，CCK8、Transwell實驗結果顯示過表達PinX1后，SKOV3 細胞活力受到抑制，細胞侵襲能力顯著降低，提示在卵巢癌細胞中，低表達的PinX1可能促進了卵巢癌的惡性增殖，且與腫瘤的浸潤轉移密切相關。

近年來研究顯示，腫瘤的發(fā)生過程中涉及眾多基因的表達異常，例如c-myc、MMP2在乳腺癌、肺癌、食管癌多種實體瘤組織中呈高表達趨勢[11,12]。c-myc作為myc基因家族的重要成員之一，通過直接響應有絲分裂信號，參與腫瘤細胞周期進程。金屬基質蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP2) 通過降解細胞外基質中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮著重要作用[13]。有報道發(fā)現下調c-myc、MMP2基因表達能明顯抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲能力[14-16]。在此基礎上，本研究為了揭示過表達PinX1導致卵巢癌細胞增殖、侵襲能力下降的原因，進一步檢測了c-myc、MMP2蛋白表達水平的變化，結果顯示 c-myc、MMP2表達明顯降低，提示PinX1可能通過調控c-myc、MMP2蛋白表達而影響卵巢癌的增殖、侵襲能力。此外，大量的研究證實c-myc、MMP2是Wnt/β-catenin信號通路下游重要靶基因，磷酸化的β-catenin通過與T細胞因子家族轉錄因子(TCF/LEF)相互作用，進入細胞核進而調控其表達，促進腫瘤細胞的增殖與侵襲[17,18]。由此提示我們，PinX1可能通過參與調控Wnt/β-catenin信號活化調節(jié)c-myc、MMP2的表達，促進卵巢癌的增殖與侵襲，而 PinX1 如何靶定其相關分子來介導這一過程目前仍不明確，有待更進一步的探索。

綜上所述，卵巢癌中低表達的PinX1通過促進卵巢癌細胞的增殖與侵襲，參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，相信隨著對PinX1基因功能研究的完善，其必將成為診斷和治療卵巢癌的新靶點。