青藤堿通過抑制缺血誘導(dǎo)的異常自噬緩解MCAO模型大鼠腦損傷①

尹曉剛 鄧 倩 潘瑞華 陳世東

(南陽醫(yī)專第一附屬醫(yī)院，南陽473000)

自噬是降解體內(nèi)受損細(xì)胞器及蛋白質(zhì)的過程。研究表明，自噬在多個(gè)生理、病理過程中都發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、感染和機(jī)體代謝紊亂等[1-3]。自噬可以調(diào)控多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究表明，抑制自噬可誘導(dǎo)阿爾茨海默病、亨廷頓氏舞蹈病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，激活自噬對腦缺血大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用[4-6]。但也有研究表明，過度自噬會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，抑制自噬、下調(diào)自噬蛋白的表達(dá)可減緩腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的死亡[7,8]。青藤堿(圖1,Sinomenine,SM)是從中藥青風(fēng)藤提取的一類生物堿，具有免疫抑制、抗炎、抗腫瘤活性[9]。研究表明，SM具有抗腦缺血損傷的作用[10]。SM還可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的自噬[11]。但青藤堿對腦缺血損傷的作用是否與調(diào)控自噬有關(guān)還未見報(bào)道。因此，本文將采用線栓法復(fù)制大鼠腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型以探究SM對腦缺血異常誘導(dǎo)的自噬的作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 青藤堿購自中國藥品鑒定所，分子式為C19H23NO4，分子量為329.38，純度≥98%，批號為120774-200507;TTC試劑購自上?；菔郎噭┕?線栓購自北京西濃科技公司;乳酸鹽脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(Malondiald-ehyde,MDA)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)和白介素-6(Interleukin,IL-6)、ELISA試劑盒購自美國Millipore試劑公司;實(shí)驗(yàn)所用一抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1動物模型構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)[12]所報(bào)道方法復(fù)制大鼠MCAO模型。實(shí)驗(yàn)所用SD雄性大鼠購自北京實(shí)驗(yàn)動物中心，體重280～320 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機(jī)分為Healthy Control組、SM組、MCAO組和MCAO+SM組。除Healthy Control組外，其余組大鼠用10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定，分離右側(cè)頸總動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，遠(yuǎn)心端用動脈夾夾閉，用眼科剪于頸總動脈分叉1 cm處剪口將線栓插入，輕緩?fù)七M(jìn)使線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈，最后再次調(diào)整角度使線栓進(jìn)入大腦中動脈。線栓插入深度約為18 mm、90 min后拔出線栓，恢復(fù)大腦供血。整個(gè)過程均用激光多普勒監(jiān)測大腦局部血流量，以插入線栓大腦血流量至少下降85%、再灌注后10 min恢復(fù)至80%以上的大鼠視為造模成功。Healthy Control組大鼠除不插線栓外，其余操作同其他組。

1.2.2TTC染色 連續(xù)給予大鼠SM (20 mg/kg)7 d 后，用10%水合氯醛麻醉大鼠并立即斷頭取腦，去除嗅球并制作冠狀切片。將切片置于0.2%的TTC溶液中，37℃避光處理10 min，棄去TTC溶液，加入4%多聚甲醛室溫固定24 h，用相機(jī)記錄拍照，計(jì)算腦組織梗死面積。

1.2.3免疫組化 制作大鼠腦組織冰凍切片。將切片取出復(fù)溫后，用PBS清洗3次，加入0.5%的TritonX-100室溫通透15 min，滴加10%封閉用山羊血清室溫封閉2 h，棄去血清，滴加適宜濃度的一抗(Ki67,1∶200;Caspase-3,1∶200)4℃封閉過夜。次日加入生物素標(biāo)記的二抗室溫封閉1 h，最后用DAB顯色，于顯微鏡下每片隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。

1.2.4Western blot 用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。用12%SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h，隨后加入一抗4℃封閉過夜。第二天棄去一抗，用TBST清洗3次后，加入HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，隨后滴加ECL顯色液，曝光顯影。

1.2.5ELISA 用10%水合氯醛麻醉大鼠，進(jìn)行心臟取血。將所獲得的血液以3 000 r/min轉(zhuǎn)速于4℃離心15 min，取上層血清根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測血清中LDH、MDA、NO和IL-6的含量。

2 結(jié)果

2.1SM對MCAO大鼠腦梗死的影響 為探究SM對MCAO大鼠腦梗死的影響，我們檢測了各組大鼠的腦梗死面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Healthy Control比較，SM組大鼠腦梗死率沒有明顯變化，MCAO組大鼠腦梗死率顯著升高(P<0.01，圖1)；與MCAO組比較，MCAO+SM組大鼠腦梗死率明顯降低(P<0.05，圖1)。

2.2SM對MCAO大鼠腦細(xì)胞增殖及凋亡的影響 為了探究SM對MCAO大鼠腦細(xì)胞增殖和凋亡的影響，我們檢測了增殖和凋亡標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Healthy Control比較，MCAO組大鼠腦組織Ki67陽性細(xì)胞密度明顯降低，Caspase-3陽性細(xì)胞密度明顯升高(P<0.01，圖2)；與MCAO組比較，MCAO+SM組大鼠腦組織Ki67陽性細(xì)胞密度明顯增升高，Caspase-3陽性細(xì)胞密度明顯降低(P<0.05，圖2)；此外，缺血能明顯抑制Ki67和B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)的表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表達(dá)(P<0.01,P<0.001，圖3)；SM能顯著誘導(dǎo)MCAO大鼠腦組織Ki67和Bcl-2的表達(dá)，降低Caspase-3和Bax的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01，圖3)。

2.3SM對MCAO大鼠神經(jīng)炎癥及脂質(zhì)過氧化的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺血缺氧能明顯誘導(dǎo)大鼠血清LDH、MDA、NO和IL-6的分泌(P<0.01，圖4)；SM可顯著降低MCAO大鼠血清LDH、MDA、NO和IL-6的含量(P<0.05，圖4)。

圖1 SM對MCAO大鼠腦梗死的影響Fig.1 Effect of SM on cerebral infraction of MCAO ratsNote: A.The chemical structure of SM;B.The area of cerebral infraction was determined by TTC staining.**.P<0.01 versus Healthy control group,#.P<0.05 versus MCAO group.

2.4SM對MCAO大鼠異常自噬及自噬通路的影響 為了探究SM緩解MCAO大鼠缺血損傷的機(jī)制，我們檢測了自噬標(biāo)記蛋白及自噬相關(guān)通路蛋白的表達(dá)情況。與Healthy Control比較，MCAO組大鼠腦組織Beclin1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯升高，p62表達(dá)水平明顯降低(P<0.001，圖5)；與MCAO組比較，MCAO+SM組大鼠腦組織Beclin1 表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯降低，p62表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,P<0.01，圖5)。此外，缺血能明顯抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表達(dá)，促進(jìn)Ulk1的表達(dá)(P<0.01,P<0.001，圖5)；SM能顯著緩解缺血對mTOR表達(dá)的抑制作用及對Ulk1表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05，圖5)。

圖2 SM對MCAO大鼠腦細(xì)胞增殖及凋亡的影響Fig.2 Effects of SM on cell proliferation and apoptosis of ratsNote: Immunohistochemical was performed for expressions of Ki67 and Caspase-3.**.P<0.01 versus Healthy control group,#.P<0.05 versus MCAO group.All experiments were repeated at least three times.

圖3 SM對MCAO大鼠腦組織增殖及凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of SM on proliferation-and apoptosis-related proteins of MCAO ratsNote: Western blot was employed to determine the protein levels of Ki67,Caspase-3,Bcl-2 and Bax.**.P<0.01,***.P<0.001 versus Healthy control group,#.P<0.05,##.P<0.01 versus MCAO group.GAPDH was used as loading control.

圖4 SM對MCAO大鼠神經(jīng)炎癥及脂質(zhì)過氧化的影響Fig.4 Effcts of SM on neuroinflammation and lipid peroxidationNote: The concentrations of serum LDH,MDA,NO and IL-6 were measured by ELISA assay.**.P<0.01 versus Healthy control group,#.P<0.05 versus MCAO group.

圖5 SM對MCAO大鼠異常自噬及自噬通路的影響Fig.5 Effects of SM on autophagy and autophagy-related signaling pathway of MCAO ratsNote: The protein levels of mTOR,Ulk1,Belcin1,p62 and LC3.GAPDH was used as loading control.**.P<0.01,***.P<0.001 versus Healthy control group,#.P<0.05,##.P<0.01 versus MCAO group.

3 討論

SM是中藥青風(fēng)藤的主要活性成分，常被用于治療關(guān)節(jié)炎[13]。研究表明，SM分子量較小，能透過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，因此可用于大腦疾病的治療[14]?，F(xiàn)代研究表明，青藤堿具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用，其可通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生[15]，同時(shí)還能通過AMPK通路、CRYAB/STAT3信號通路抑制缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥而減輕腦損傷[10,16]。Xie等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SM可通過抑制脂質(zhì)過氧化減輕心臟缺血再灌注后心肌損傷。SM還能抑制過氧化物H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[18]。炎癥、脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞凋亡均是導(dǎo)致腦缺血后神經(jīng)損傷的重要機(jī)制[19，20]，提示SM可能具有抗缺血誘導(dǎo)的炎癥、脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SM可明顯促進(jìn)MCAO大鼠大腦細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67的表達(dá)，抑制凋亡標(biāo)記蛋白Caspase-3及Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡[21]，表明SM可促進(jìn)缺血后神經(jīng)細(xì)胞增殖，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，SM還能抑制細(xì)胞炎癥因子NO、IL-6及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物L(fēng)DH和MDA的釋放，提示SM可通過抑制神經(jīng)炎癥、脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞凋亡抗大鼠腦缺血損傷。

研究表明，自噬參與了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡過程的調(diào)控[22,23]。適當(dāng)?shù)淖允煽蔀槿毖笊窠?jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[24]。過度自噬則會加速神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，加重腦缺血損傷[12]。缺氧可誘導(dǎo)大量自噬體的形成，抑制自噬還可減少缺糖缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元的死亡[25]。本文研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能明顯升高大鼠腦組織Beclin1的蛋白表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，抑制p62的表達(dá)。Beclin1在自噬的起始階段發(fā)揮重要作用，LC3則主要參與自噬小體的形成，敲除Beclin1可通過抑制自噬減輕腦缺血后神經(jīng)變性[26]。p62表達(dá)于細(xì)胞核，其隨自噬的進(jìn)行被不斷降解，表達(dá)水平與自噬呈負(fù)相關(guān)[27]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)自噬。給予MCAO大鼠SM 7 d后，Beclin1的表達(dá)水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯降低，p62表達(dá)水平明顯升高，表明SM可顯著抑制缺血誘導(dǎo)的異常自噬。研究表明，下調(diào)自噬可縮小腦缺血大鼠的腦梗死面積，抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡，激活自噬則會加重腦損傷[28]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)SM在抑制自噬的同時(shí)也可明顯減小腦梗死面積，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提示SM減輕缺血誘導(dǎo)的腦損傷可能與其抑制自噬有關(guān)。

mTOR/Ulk1信號通路是調(diào)控自噬的經(jīng)典通路之一[29]。下調(diào)mTOR可通過誘導(dǎo)Ulk1復(fù)合物的形成促進(jìn)Beclin1活化、誘導(dǎo)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化而促進(jìn)自噬小體的形成[30]。研究表明，mTOR/Ulk1信號通路參與了腦缺血后自噬的調(diào)控。Bin等[31]研究發(fā)現(xiàn)，中藥提取物川芎嗪可通過mTOR/Ulk1信號通路誘導(dǎo)自噬，減輕缺血損傷。并且針灸治療腦缺血損傷也與通過mTOR/Ulk1通路調(diào)控自噬有關(guān)[32]。我們已經(jīng)證明SM可通過調(diào)控Beclin1、LC3和p62表達(dá)抑制缺血誘導(dǎo)的自噬，因此，我們檢測了自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SM可顯著上調(diào)MCAO大鼠腦組織mTOR的表達(dá)水平，抑制Ulk1表達(dá)，從而抑制mTOR/Ulk1通路的激活，抑制缺氧誘導(dǎo)的異常自噬。也有研究表明，下調(diào)mTOR的表達(dá)可抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33]。提示，SM可能通過mTOR/Ulk1通路的激活，抑制缺血誘導(dǎo)的自噬而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜合所述，SM可通過下調(diào)缺血誘導(dǎo)的異常自噬促進(jìn)MCAO大鼠腦細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，并且其機(jī)制可能與抑制mTOR/Ulk1通路激活有關(guān)。本研究可能為SM應(yīng)用于腦缺血損傷的治療提供了新的理論支撐。