AR-A014418對γδT細胞增殖、凋亡及殺傷功能的影響①

鄭 璐 孫蕾清 陳復(fù)興 周 燏 呂小婷 陳 玲 李 瑩 周忠海 陳永強

(解放軍第97醫(yī)院中心實驗室，徐州221004)

Wnt/β-catenin信號通路是一條在進化中極為保守的通路，在調(diào)控干細胞的形成、細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程中起重要作用[1,2]。由于在許多腫瘤中Wnt/β-catenin信號通路異?；罨?，許多研究發(fā)現(xiàn)該通路可以作為腫瘤治療的靶點并研發(fā)出一系列Wnt信號通路抑制劑，目前已經(jīng)進入臨床試驗[3,4]。近年來腫瘤患者自身免疫細胞及嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞免疫療法成為研究的熱點。Gattinoni等[5]利用Wnt信號通路激活劑TWS119活化T淋巴細胞的Wnt/β-catenin信號通路可以獲得一群在體內(nèi)具有較強的增殖和腫瘤殺傷活性的干細胞樣記憶CD8+T細胞 (TSCM)，而且還發(fā)現(xiàn)CD19-CAR TSCM體內(nèi)抗腫瘤效果優(yōu)于傳統(tǒng)的CD19-CAR T細胞[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)TWS119還可以調(diào)節(jié)γδT細胞的分化、增殖及腫瘤殺傷活性[7,8]。AR-A014418(圖1)也是一種選擇性的GSK3β抑制劑，可以通過抑制GSK3β酶活性活化Wnt信號通路[9]。因此，本研究想觀察Wnt信號通路激活劑AR-A014418對γδT細胞增殖、凋亡及其腫瘤殺傷活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 AR-A014418購自MCE公司，用二甲亞砜(DMSO)溶解配制成20 mmol/L的母液于-20℃儲存；Annexin V-FITC/7-AAD apoptosis 試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；CFSE購自Invitrogen公司；帕米磷酸二鈉購自深圳海王藥業(yè)有限公司；RPMI1640和小牛血清購自Gibco 公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；熒光抗體APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR購自BD公司；Western及IP細胞裂解液試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、PVDF膜和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-Tublin一抗購自Abcam公司；人AB型血清購自徐州市血站。

1.2方法

1.2.1γδT細胞的培養(yǎng)及鑒定 抽取健康人外周抗凝血10 ml，用生理鹽水1∶1稀釋后加入淋巴細胞分離液，1 800 r/min離心15 min，分離獲得人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。將分離獲得的PBMCs加入γδT細胞完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清、5%AB血清、3 μmol/L的帕米膦酸二鈉和200 U/ml rhIL-2)中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。取培養(yǎng)10 d的γδT細胞用APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR抗體標記細胞用流式細胞儀進行γδT細胞鑒定。

1.2.2細胞計數(shù)儀法檢測AR-A014418對γδT細胞增殖的影響 取培養(yǎng)10 d的γδT細胞，調(diào)整細胞數(shù)1.0×106ml-1加入12孔板，加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，每組設(shè)3個復(fù)孔，對照組加入等量的DMSO。培養(yǎng)72 h后取每組的細胞懸液用細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)。

圖1 AR-A014418結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of AR-A014418

1.2.3流式細胞儀檢測AR-A014418對γδT細胞增殖的影響 取培養(yǎng)10 d的γδT細胞，用生理鹽水將γδT細胞配成濃度為1.0×107ml-1的細胞懸液，加入終濃度為1 μmol/L的CFSE，37℃孵育15 min后加入10倍體積的完全培養(yǎng)基終止染色，離心洗滌2遍后，將CFSE標記的γδT細胞接種于12孔培養(yǎng)板，然后加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，對照組加入等量的DMSO。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收集細胞并用PBS洗滌1次，每管加入anti-γδTCR-APC 5 μl，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細胞術(shù)檢測γδT細胞的增殖情況，試驗重復(fù)3次。

1.2.4流式細胞儀檢測AR-A014418對γδT細胞凋亡的影響 取培養(yǎng)10 d的γδT細胞，調(diào)整細胞數(shù)1.0×106ml-1加入12孔板，加入終濃度分別為0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，對照組加入等量的DMSO。培養(yǎng)72 h后收集細胞并用PBS洗滌1次，根據(jù)Annexin V-FITC/7-AAD 凋亡試劑盒說明書操作步驟，每管分別加入Annexin V-FITC和7-AAD，染色結(jié)束后用流式細胞術(shù)檢測γδT細胞凋亡比例，試驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞儀檢測γδT細胞體外殺傷活性 將AR-A014418處理72 h后的γδT細胞(效應(yīng)細胞)與CFSE標記的人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞(靶細胞)按照效應(yīng)細胞與靶細胞10∶1和20∶1的比例加入96孔U型孔中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。收集細胞并用PBS洗滌1次，每管加入7-AAD 5 μl,室溫避光孵育5 min后，重懸于0.5 ml的PBS溶液中，用流式細胞術(shù)檢測HepG2和SGC-7901細胞的凋亡情況，試驗重復(fù)3次。

1.2.6Western blot分析蛋白的表達 γδT細胞經(jīng)AR-A014418處理72 h后，收集細胞用Western及IP細胞裂解液50 μl充分裂解提取蛋白，BCA法測樣品蛋白濃度后用12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶1 000) 4℃封閉過夜，二抗(1∶1 000) 37℃孵育1 h。然后用成像系統(tǒng)檢測并拍照，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1γδT細胞鑒定 分離獲得人外周血單個核細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用γδT細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后流式細胞儀鑒定，結(jié)果如圖2A、B顯示，Pan γδT細胞純度達到(87.6±4.3)%，Vδ2 T細胞比例約為(84.6±3.1)%。以上結(jié)果提示γδT 細胞培養(yǎng)成功，而且以Vδ2 T細胞為主可用于后續(xù)實驗。

2.2AR-A014418對γδT細胞增殖的影響 CFSE 是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，CFSE 進入細胞后可以不可逆地與細胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。在細胞分裂增殖過程中，CFSE 標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖3A、 B顯示AR-A014418濃度在0.3～3 μmol/L 范圍內(nèi)能顯著促進γδT細胞的增殖，其中3 μmol/L 時增殖率最大 (P<0.05,P<0.01)，而當濃度大于3 μmol/L后γδT細胞增殖率又降低。細胞計數(shù)儀計數(shù)結(jié)果也同樣顯示AR-A014418在3 μmol/L時γδT細胞數(shù)由對照組的(3.18±0.12)×106個升高到(4.21±0.26)×106個(P<0.05,P<0.01)(圖3C)。另外，如圖3D所示AR-A014418對γδT細胞亞群的改變沒有明顯變化。

圖2 γδT細胞鑒定Fig.2 Identification of γδT cells

2.3AR-A014418對γδT細胞凋亡的影響 培養(yǎng)10 d后的γδT細胞再經(jīng)AR-A014418處理72 h后，經(jīng)Annexin V-FITC /7-AAD雙染后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖4A、B所示，對照組γδT細胞凋亡率為(25.14±1.94)%，而經(jīng)0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418處理后，細胞凋亡率分別為：(21.08±1.37)%、(18.38±2.83)%、(16.01±2.33)%和(22.57±1.89)%。以上結(jié)果表明AR-A014418體外可以抑制γδT細胞的凋亡(P<0.05,P<0.01)。同時，經(jīng)0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418處理72 h后，蛋白水平檢測顯示，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax表達量逐漸減弱，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量逐漸增強(圖4C)。

2.4AR-A014418對γδT細胞殺傷人腫瘤細胞活性的影響 根據(jù)以上實驗結(jié)果顯示，3 μmol/L的AR-A014418促進γδT細胞增殖且抑制其凋亡結(jié)果最顯著。因此我們選擇3 μmol/L的AR-A014418處理72 h 后的γδT細胞作為效應(yīng)細胞，以人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞作為靶細胞，按照效靶比分別為10∶1和20∶1進行體外殺傷實驗檢測。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖5A、B所示，與對照組相比，3 μmol/L AR-A014418處理后的γδT細胞對人肝癌HepG2細胞殺傷效率 (18.01±2.04)% vs (33.8±3.41)%和(36.03±2.76)% vs (57.82±4.15)%顯著提高(P<0.01)；對人胃癌SGC-7901細胞殺傷效率 (27.30±1.70)% vs (42.43±3.93)% 和(46.82±4.61)% vs (71.67±5.27)%顯著提高(P<0.05,P<0.01)。以上結(jié)果顯示AR-A014418可以增強γδT細胞的體外殺傷腫瘤活性。

圖3 AR-A014418對γδT細胞增殖的影響Fig.3 Effect of AR-A014418 on growth of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 AR-A014418對γδT細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of AR-A014418 on apoptosis of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

圖5 AR-A014418處理后的γδT細胞對人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞的殺傷效應(yīng)Fig.5 Killing activities of γδT cells treated with AR-A014418 against HepG2 and SGC-7901 cells

3 討論

γδT細胞是T淋巴細胞中表達γδTCR的一個亞群，是近年來研究較多的抗腫瘤免疫效應(yīng)細胞之一，主要以MHC非限制性方式識別腫瘤抗原從而發(fā)揮殺傷作用[10]。目前體外常規(guī)擴增的γδT細胞已經(jīng)用于多種腫瘤的治療，并取得較好的療效[11,12]。為了提高γδT細胞治療腫瘤效果，目前國內(nèi)外研究主要集中于通過多種細胞因子和藥物等進行誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT細胞及條件優(yōu)化，來提高γδT細胞的體外增殖倍數(shù)及殺傷功能[8,13-16]。本實驗結(jié)果顯示，AR-A014418在0.3～3 μmol/L濃度范圍時不僅能促進體外γδT細胞的增殖，而且還能抑制其凋亡，尤其在3 μmol/L效果最為顯著。另外在3 μmol/L時AR-A014418還能增強γδT細胞的體外殺傷人肝癌HepG2細胞和人胃癌SGC-7901細胞活性。提示AR-A014418可以提高體外培養(yǎng)γδT細胞的數(shù)量和功能，為今后體外擴增γδT細胞用于腫瘤患者細胞免疫治療提供了實驗依據(jù)。

糖原合酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase -3β，GSK-3β)是Wnt/β-catenin信號通路的負向調(diào)節(jié)激酶，是藥物篩選的重要靶點。目前針對該靶點的靶向藥物Lithium和Valproic acid已獲批分別用于治療抑郁癥和癲癇??；Flavopiridol 和Staurosporine 用于晚期實體瘤和血液病的治療已經(jīng)進入臨床Ⅱ期[17]。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)GSK-3β抑制劑TWS119在體外可以增強γδT細胞的增殖和腫瘤殺傷活性[7,8]。本研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β另一抑制劑AR-A014418也具有類似功能，提示我們GSK-3β可能成為今后體外擴增γδT細胞的有效靶點。

綜上所述，GSK-3β抑制劑AR-A014418在3 μmol/L 濃度時，可以抑制體外擴增γδT細胞的凋亡，并且還能增強其體外增殖和殺傷腫瘤活性。結(jié)合前期研究和上述結(jié)論說明GSK-3β可能成為今后體外擴增γδT細胞的有效靶點，以及GSK-3β抑制劑AR-A014418具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，為今后的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。