表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究①

劉 晶 張 贊 劉 洋 楊桂連 姜延龍 王春鳳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118)

結(jié)核病 (Tuberculosis，TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis,MTB)引起的人獸共患的慢性傳染病，目前仍然是一個(gè)主要的全球性健康問(wèn)題,可累及全身多個(gè)器官，但以肺結(jié)核(Pulmonary tuberculosis，PTB)最為常見(jiàn)。目前廣泛用于預(yù)防 TB 的唯一經(jīng)過(guò)許可的疫苗就是卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)，但只是在嬰幼兒身上發(fā)揮作用[1]，在保護(hù)青少年和成年人的肺病中卻受限，而且隨著年齡的增長(zhǎng)產(chǎn)生的記憶性免疫會(huì)降低[2]；BCG是全菌疫苗，可引起淋巴結(jié)腫大和化膿等異常反應(yīng)，所以改造卡介苗和開(kāi)發(fā)安全有效的新疫苗勢(shì)在必行。ESAT-6是一個(gè)大小為6 kD的早期分泌靶抗原，是最具有免疫能力的特定靶向抗原，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。結(jié)核分枝桿菌中主要的保護(hù)性抗原是抗原85(Ag85),在對(duì)抗結(jié)核病中具有保護(hù)作用[3,4]。Ag85A是一種免疫顯性的蛋白，可以增加Th1型免疫反應(yīng)[5]，刺激IFN-γ的產(chǎn)生[6]。表達(dá)Ag85A和ESAT-6 融合蛋白的DNA疫苗能使小鼠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)[7]。

pValac是經(jīng)過(guò)改造后的真核表達(dá)質(zhì)粒，含有巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(pCMV)和BGH polyA結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有大腸桿菌和乳酸菌復(fù)制子RepC 和RepA，因此也屬于真核穿梭表達(dá)載體[8]。NC8-pSIP-409-FnBPA是具有侵入宿主細(xì)胞能力的侵入型乳酸菌。本實(shí)驗(yàn)的目的是在侵入型乳酸菌的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)入表達(dá)ES85A抗原的真核質(zhì)粒，構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)的侵入型重組乳酸菌，該侵入型乳酸菌可作為口服DNA疫苗載體，在畜禽病毒性、寄生蟲(chóng)類(lèi)疫病防控中有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒載體 真核表達(dá)載體pValac、大腸桿菌TG1感受態(tài)、重組乳酸菌感受態(tài)NC8-pSIP-409和NC8-pSIP-409-FnBPA由本實(shí)驗(yàn)制備并保存。

1.1.2動(dòng)物 健康的雌性BALB/c小鼠20只,5～6周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，隨機(jī)分成4組，每組5只，4組依次為PBS、pValac/409(空載體組)、pValac-ES85A/409和pValac-ES85A/FnBPA。

1.1.3儀器和試劑 LSRFortessaTM流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;Epoch2酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek;LSM710型共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)。普通質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)；PrimeSTAR Max Premix(×2)，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，DL5000 marker，5×SDS buffer由寶生物(TaKaRa)公司提供；紅霉素為Amresco公司分裝；氯霉素購(gòu)自EBT公司；電轉(zhuǎn)杯由Bio-Rad公司提供；硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自Whatman公司;Anti-FLAG抗體(鼠源)以及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自康為世紀(jì)；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠的IgG抗體購(gòu)自鼎國(guó)公司;低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海生物工程有限公司;流式抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；ELISA試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；其他主要試劑為進(jìn)口產(chǎn)品或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1目的基因的序列分析及基因合成 根據(jù)GenBank登錄的基因序列，選取酶切位點(diǎn)KpnⅠ和XbaⅠ，設(shè)計(jì)ESAT-6-Ag85A基因序列并送去蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2目的基因ESAT-6-Ag85A(ES85A)與真核表達(dá)載體pValac的連接 對(duì)pValac真核載體以及合成的質(zhì)粒pUC57-ES85A分別采用KpnⅠ/XbaⅠ進(jìn)行雙酶切及膠回收，對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用T4連接酶將基因ES85A和pValac進(jìn)行16℃連接過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)化到E.coli TG1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，并涂于含有氯霉素的LB平板(Cm的終濃度是10 μg/ml)上，挑取單克隆并使用搖床進(jìn)行擴(kuò)充培養(yǎng)，采用康為世紀(jì)的質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，提取重組質(zhì)粒，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)酶切切開(kāi)的質(zhì)粒送去吉林省庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3將構(gòu)建好的真核質(zhì)粒pValac-ES85A轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 培養(yǎng)293T細(xì)胞,將培養(yǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞鋪6孔和24孔(含有賴(lài)氨酸處理的細(xì)胞爬片)細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為6孔：5.0×105/孔；24孔:2.0×105/孔,37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞長(zhǎng)至單層;使用Invitrogen的Lipofectamine 3000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染之后6孔補(bǔ)加2 ml和24孔補(bǔ)加1 ml完全培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。

1.2.4使用Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞沉淀，進(jìn)行蛋白的抽提。首先，使用PBS漂洗細(xì)胞3次；其次，每孔加入300 μl 預(yù)冷的Mammalian protein Extraction Reagent (抽提細(xì)胞前2～3 min,按1∶99比例加Protease Inhibitor cocktail),在冰上用槍頭吹打細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，冰浴20 min，充分裂解；最后，收集裂解液，14 000 g離心10 min，收集上清，加入相應(yīng)的5×SDS loading buffer混勻,沸水中煮沸10 min，12 000 g 離心10 min備用;根據(jù)TaKaRa商品目錄，分別配置12%分離膠(3 ml)和5%濃縮膠(2 ml)，按照之前的方法進(jìn)行配膠以及Western blot檢測(cè)[9]。第一抗體是康為世紀(jì)的鼠源Anti-FLAG標(biāo)簽抗體,二抗是HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG；最后使用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.5使用間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的熒光表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染后的24孔板細(xì)胞，使用PBS漂洗細(xì)胞20 min,每孔加入一定量的4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBST(0.5%Tween 20)洗3次，每次5 min；每孔加入500 μl 的0.5% Triton X-100，室溫放置30 min，再次使用PBST進(jìn)行洗滌細(xì)胞;使用2%BSA封閉液37℃恒溫箱封閉30 min，每孔加入稀釋后的鼠源Anti-FLAG標(biāo)簽抗體，4℃孵育過(guò)夜;PBST洗3次,每孔加入一定量的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃水平搖床避光孵育30 min;PBST洗3次，加入細(xì)胞核染料DAPI，室溫避光染色15 min,PBST洗3次，最后使用抗熒光衰減劑進(jìn)行封片，使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.6真核質(zhì)粒pValac-ES85A電轉(zhuǎn)侵入型乳酸菌 取10 μl重組質(zhì)粒pValac-ES85A分別加入到NC8-pSIP409和NC8-pSIP409-FnBPA感受態(tài)中，輕緩混勻，移入預(yù)冷的0.2 cm間距的電擊杯內(nèi)，冰浴5 min 后，放入電轉(zhuǎn)化儀(2.5 kV，6 ms)中進(jìn)行電擊，電擊結(jié)束后，加入800 μl的MRS培養(yǎng)液中，再加入150 μl的蔗糖溶液(蔗糖濃度0.5 mol/L)，混勻緩慢吸到1.5 EP管中，30℃水浴3 h；離心，全部涂于含有Em和Cm (終濃度都是10 μg/ml)的雙抗性 MRS 固體培養(yǎng)基上，30℃厭氧條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出狀態(tài)良好的單個(gè)菌落。挑取單克隆接種于含 Em和Cm的雙抗性MRS培養(yǎng)液中，30℃厭氧條件下過(guò)夜培養(yǎng)，菌液渾濁的就應(yīng)該是陽(yáng)性菌，保存菌種，分別命名為pValac-ES85A/409 和pValac-ES85A/FnBPA，存放于-80℃用于后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 在第0、1、2、14、15、16、28、29、30天進(jìn)行免疫，免疫劑量為109 CFU/(100 μl·只)，采用口服灌胃的方式，PBS組免疫等量的PBS。在免疫后的第42天，處死小鼠，眼球采血，制備血清，-80℃?zhèn)溆?。取小鼠的脾臟，按照文獻(xiàn)[10]中的方法制備脾臟的單細(xì)胞懸液。同時(shí)加入鼠源的APC標(biāo)記的CD11c、PerCP-Cy5.5標(biāo)記的CD80以及PE標(biāo)記的CD83流式抗體，室溫避光孵育30 min,使用PBS洗2次，4℃，2 000 r/min離心5 min,留細(xì)胞懸液約200 μl，移到流式管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)的顯著性差異進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)平均誤差(SEM)對(duì)多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1目的基因ES85A和pValac的酶切片段及重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 使用KpnⅠ和XbaⅠ對(duì)載體和目的片段進(jìn)行雙酶切回收，可見(jiàn)成功回收到3 666 bp 的pValac載體片段及1 450 bp的ES85A片段，如圖1A，對(duì)其構(gòu)建之后的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1B。重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI上的BLAST比對(duì)，同源性達(dá)99%以上。

2.2Western blot檢測(cè)結(jié)果 采用Western blot檢測(cè)重組融合蛋白ES85A的表達(dá)情況，收集轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后的細(xì)胞沉淀進(jìn)行檢測(cè)，可見(jiàn)在53 kD處出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的蛋白條帶，而陰性對(duì)照中未見(jiàn)到任何的蛋白條帶，如圖2。

2.3間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 將構(gòu)建好的真核質(zhì)粒pValac-ES85A轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后使用間接免疫熒光標(biāo)記目標(biāo)蛋白，使用共聚焦顯微鏡觀察(×400)，如圖3A所示，轉(zhuǎn)染空載體pValac質(zhì)粒的細(xì)胞中，沒(méi)有任何的蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染pValac-ES85A質(zhì)粒的細(xì)胞中可以看出蛋白ES85A的大量表達(dá)(圖3B)；圖3C中是轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒pValac-gfp，可見(jiàn)有大量的gfp表達(dá)。

圖1 ES85A和pValac的酶切片段及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Identification of ES85A and pValac by double digestion as well as recombinant plasmid by double digestionNote: Fig.A.1.Product of pValac vector (KpnⅠ/XbaⅠ) by double digestion；2.Product of ES85A gene (KpnⅠ/XbaⅠ) by double digestion;Fig.B.1.Identification of pValac-ES85A by double digestion;M.DL5000 marker.

圖2 Western blot檢測(cè)ES85A融合蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of ES85A fusion protein in 293T cells by Western blotNote: M.Low molecular weight protein marker;1.Expression of control vector pValac in 293T cells;2.Expression of pValac-ES85A in 293T cells.

圖3 共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后ES85A蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of ES85A protein after transfection 293T cells 48 h was observed by confocal microscopeNote: A.Negative control：pValac；B.Plasmid pValac-ES85A of transfection;C.Positive control:pValac-gfp.Cell nucleus was labeled using blue and expressing protein or gfp were labeled by green.The blue and green were merged in the pictures.

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)ES85A的侵入型乳酸菌對(duì)小鼠DCs亞群的影響 使用流式抗體CD11c、CD80和CD83標(biāo)記處理好的脾細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)與空載體組相比，表達(dá)ES85A蛋白的重組乳酸菌組更能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞中CD11+CD80+(P<0.001) 和CD11+CD83+(P<0.01)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞的分化和成熟。

2.5ELISA檢測(cè)結(jié)果 收集免疫后第42天的小鼠血清，使用ELISA檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的表達(dá)情況。結(jié)果顯示與空載體組相比，表達(dá)ES85A的重組乳酸菌中IL-4的含量顯著升高，尤其是表達(dá)ES85A的侵入型乳酸菌的效果更顯著(P<0.05)，但I(xiàn)FN-γ含量各組之間沒(méi)有顯著的差異，如圖5。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中DCs亞群的變化Fig.4 Detection of DCs subsets in spleen cells from mice using flow cytometryNote: A.The DC gating strategy；B.Expression levels of CD11+CD80+and CD11+CD83+were analysed by flow cytometry.***.P<0.001,**.P<0.01,*.P<0.05.

圖5 ELISA檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的表達(dá)Fig.5 Expression of cytokines IL-4 and IFN-γ in serum from mice were detected by ELISANote: A.Expression of IL-4 in serum;B.Expression of IFN-γ in serum.**.P<0.01,*.P<0.05.

3 討論

乳酸菌屬于益生菌，可以作為DNA疫苗的遞送載體，但其遞送效率不高[11]，為了提高遞送效率，我們構(gòu)建了表達(dá)FnBPA的侵入型植物乳桿菌NC8[12]。這種新型的乳酸菌遞送載體可以提高表達(dá)外源抗原的遞送效率。結(jié)核病是全球健康的一個(gè)大問(wèn)題，在結(jié)核分枝桿菌中ESAT-6和Ag85A基因在對(duì)抗小鼠結(jié)核病中起到了保護(hù)作用[7]，對(duì)其DNA疫苗載體的選擇，表達(dá)FnBPA的侵入型乳球菌作為DNA疫苗遞送載體成為研究的熱點(diǎn)。研究表明編碼Ag85A抗原的侵入型乳球菌能增強(qiáng)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-6 和 TNF-α的表達(dá)水平[13]，編碼ESAT-6抗原的侵入型乳球菌能提高細(xì)胞因子IL-17的分泌[14]，并且重組的結(jié)核桿菌Ag85A-ESAT-6融合蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中能成功表達(dá)并且具有生物活性[15]。本文的目的是在現(xiàn)有的表達(dá)FnBPA的侵入型植物乳桿菌NC8作為DNA疫苗遞送載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了表達(dá)ESAT-6-Ag85A抗原的侵入型乳酸菌。樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)屬于抗原遞呈細(xì)胞，能夠?qū)⒖乖f送給T細(xì)胞，最后引起一系列的免疫反應(yīng)，因此我們對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的表型進(jìn)行了檢測(cè)。將構(gòu)建好的表達(dá)ES85A的侵入型乳酸菌免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)DCs亞群CD80和CD83的表達(dá)，結(jié)果表明ES85A蛋白的表達(dá)能促進(jìn)DCs的分化和成熟，尤其是以侵入型乳酸菌為遞送載體的效果更好。這或許是因?yàn)楸磉_(dá)FnBPA的侵入型乳酸菌由于具有侵入細(xì)胞的能力，進(jìn)而增加了與DCs的結(jié)合效率。下一步的工作將會(huì)進(jìn)一步研究表達(dá)ES85A蛋白的侵入菌株對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫細(xì)胞的影響，為后期研制抗結(jié)核病的DNA的疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。