鮭鱒通用型低通量單核苷酸多態(tài)性芯片的開發(fā)*

邰如玉 許 建 江炎亮 張瀚元 白慶利 楊世勇 徐 鵬,5 趙紫霞①

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2.中國水產科學研究院農業(yè)農村部水生動物基因組學重點實驗室 漁業(yè)生物技術北京市重點實驗室 北京 100141；3.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所 哈爾濱 150070；4.四川農業(yè)大學動物科技學院 雅安 625014；5.廈門大學海洋與地球學院 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心 廈門 361102)

鮭鱒是鮭科(Salmonidae)多種魚類的統(tǒng)稱，是冷水魚主要養(yǎng)殖品種，在中高端水產品市場中占據(jù)了重要份額。我國有良好的冷水資源以及多樣化的鮭鱒養(yǎng)殖品種，除年產量最高的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)外，還有銀鮭(Oncorhynchus kisutch) (又稱“銀大麻哈魚”)、山女鱒(Oncorhynchus masou masou)、美洲紅點鮭(Salvelinus fontinalis)(商品名“七彩鮭”)、白斑紅點鮭(商品名“白點鮭”)(Salvelinus leucomaenis)等均已形成了一定的養(yǎng)殖規(guī)模(孫大江等, 2010; 戶國等,2012)。

由于各種鮭鱒養(yǎng)殖品種對生境的要求類似，我國鮭鱒養(yǎng)殖的地域比較集中，往往同一育苗場或養(yǎng)殖場同時養(yǎng)殖多種鮭科魚類，這些養(yǎng)殖物品種主要集中于大麻哈魚屬(Oncorhynchus)和紅點鮭屬(Salvelinus)，但除虹鱒外，其他鮭鱒養(yǎng)殖種現(xiàn)有的基因組資源和遺傳分析工具十分有限，以往的遺傳分析主要基于線粒體 DNA(Yuet al, 2010)和微衛(wèi)星標記(Smallet al,2010; Naishet al, 2013)來開展，通常標記數(shù)量較少，基因組覆蓋度較低，并且針對不同的物種需要開發(fā)不同的標記，通用性較低。

本研究基于虹鱒 57K單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)芯片(Paltiet al, 2015)，致力于開發(fā)常見鮭鱒養(yǎng)殖種間通用的分子標記，形成小型 SNP芯片，從而利用同一套分子標記和檢測方法，實現(xiàn)對多個鮭鱒養(yǎng)殖物種的遺傳分析，將有利于顯著降低遺傳檢測成本、簡化技術人員培訓流程、提升科學養(yǎng)殖管理效率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

山女鱒、美洲紅點鮭、白斑紅點鮭采自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所渤海冷水性魚試驗站，銀鮭采自四川省都江堰市三文魚養(yǎng)殖基地和中國水產科學研究院房山試驗基地。每個群體或家系各采樣20尾，剪取尾鰭貼于干燥的濾紙上，56℃烘干6 h，常溫保存。

1.2 DNA提取

使用海洋動物基因組 DNA提取試劑盒(天根生化)提取基因組 DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA完整性，NanoDrop 8000超微量紫外可見光分光光度計(Thermo Fisher)檢測DNA純度和濃度。

1.3 高通量SNP芯片分型

對山女鱒、美洲紅點鮭、白斑紅點鮭、銀鮭4個群體進行線粒體控制區(qū)測序，檢測個體單倍型，每個群體選取DNA質量高、具有不同單倍型的8個樣本用于57K虹鱒SNP芯片(Affymetrix)分型，分別記為OK1～8(銀鮭)，OM1～8(山女鱒)，SF1～8(美洲紅點鮭)，SL1～8(白斑紅點鮭)。分型實驗由紐勤生物科技(上海)有限公司完成，使用 SNPolisher軟件(Affymetrix)讀取分型數(shù)據(jù)。使用PLINK 1.09(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)(Purcellet al, 2007)進行分型結果過濾、統(tǒng)計和連鎖不平衡(Linkage disequilibrium, LD)檢驗，個體質控標準設為Call rate (CR)>80%，位點質控標準設為CR>97%。

1.4 低通量SNP芯片分型

96個SNP位點由Fluidigm公司設計合成探針，使用 EP1平臺及 96.96動態(tài)芯片(Fluidigm)開展分型檢測。檢測樣本共計96尾，包括進行過高通量SNP芯片檢測的樣本32尾，以及新增銀鮭樣本64尾，其中，新增樣本包含銀鮭養(yǎng)殖家系6個，每個家系樣本各8尾(記為OK9～56)，以及養(yǎng)殖家系候選親本16尾(記為OK57～72)，其中，部分家系互為半同胞，其真實親本為5尾雌魚和3尾雄魚。通過Fluidigm SNP genotyping analysis software 4.1軟件讀取分型結果，質控閾值設為85，對缺失和低質量分型數(shù)據(jù)進行人工復檢。使用Cervus 3.0.7進行遺傳多態(tài)性統(tǒng)計，并對48尾銀鮭樣本(OK9～56)進行親權鑒定(Kalinowskiet al,2007)。使用Structure 2.3.4 (http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)，對 32尾鮭鱒群體樣本(OK1～8、OM1～8、SF1～8和 SL1～8)進行群體遺傳結構分析(Falushet al, 2003; Hubiszet al, 2009)。

2 結果

2.1 虹鱒高通量SNP芯片在國內代表性鮭鱒養(yǎng)殖群體中的多態(tài)性分析

使用虹鱒57K SNP芯片，對國內4個代表性鮭鱒養(yǎng)殖群體樣本進行分型檢測，包括大麻哈魚屬的山女鱒、銀鮭，以及紅點鮭屬的美洲紅點鮭和白斑紅點鮭，每個群體選取8尾個體。該芯片共包含虹鱒多態(tài)性位點57,501個，32尾個體全部通過CR>80%的質控標準，即每尾個體分型成功的位點數(shù)均大于80%。位點質控標準設為CR>97%，即僅統(tǒng)計基因型無缺失的位點。各群體多態(tài)性位點統(tǒng)計結果如表1所示，其中，群體間分型位點比例波動較小，在 65.96%～74.19%范圍內，但多態(tài)性位點比例差異很大，銀鮭群體內僅有9.01%的多態(tài)性位點，而美洲紅點鮭群體內多態(tài)性位點比例達到45.99%。

2.2 鮭鱒群體間共享多態(tài)性位點篩選

圖1以韋恩圖的形式展示了4個鮭鱒群體間多態(tài)性 SNP位點的分布，包括群體間共享的和群體特異性的多態(tài)位點，其中，4個群體共享的多態(tài)性位點有89個。為了避免基因組內緊密連鎖的位點同時入選，在32尾鮭鱒個體中對共享多態(tài)性位點進行LD檢驗，剔除R2值高于0.3的位點4個。根據(jù)共享多態(tài)性位點側翼序列設計Fluidigm分型探針，進一步剔除探針設計失敗位點6個，獲得用于構建鮭鱒通用SNP芯片的共享多態(tài)性位點79個。由于位點數(shù)目不足96個，從山女鱒、美洲紅點鮭和白斑紅點鮭3個群體共享的448個多態(tài)性位點中選取補充位點 17個，選擇標準為：經LD檢驗，與已入選位點間R2值低于0.3，并能夠成功設計分型探針。96個入選位點的側翼序列及基因組定位信息見表1。最終入選的芯片位點中，編號OS-79及以前的位點，為4群體共享多態(tài)位點，編號OS-80及以后的位點，為3群體共享多態(tài)位點。

表1 鮭鱒代表性群體多態(tài)性SNP位點數(shù)目和比例Tab.1 Number and percentage of polymorphic SNPs in representative Salmonid populations

圖1 國內4個代表性鮭鱒養(yǎng)殖群體的多態(tài)性SNP位點韋恩圖Fig.1 Venn diagram for distribution of shared polymorphic SNPs among 4 representative salmonid populations in China

2.3 低通量SNP芯片位點多態(tài)性分析

使用構建的鮭鱒通用型低通量SNP芯片對96尾鮭鱒養(yǎng)殖個體進行分型檢測，在總計9216個分型反應中，分型成功率為97.48%，檢測樣本中，32尾個體與高通量芯片檢測樣本相同，其檢測結果一致性為96.55%。各位點遺傳多態(tài)性統(tǒng)計結果見表2。

2.4 基于低通量SNP芯片的養(yǎng)殖家系親權鑒定

基于鮭鱒通用型低通量 SNP芯片分型數(shù)據(jù)，應用Cervus 3.0.7軟件對來自6個家系的48尾銀鮭個體進行親權鑒定，將同批次檢測的其他48尾鮭鱒樣本均作為待分析親本群體，結果表明，無論是單親本鑒定還是雙親本鑒定，基于96個位點分型數(shù)據(jù)的親權鑒定結果均與真實系譜相符。

根據(jù)表 2中列出的各位點第一親本非排除率(Non-exclusion probability for first parent, NE-1P)和雙親非排除率(Non-exclusion probability for parent pair,NE-PP)，計算得該芯片用于單親本親權鑒定的NE-1P值為4.120×10–4，用于雙親本親權鑒定的NE-PP值為6.219×10–12。圖 2展示了該芯片用于 48尾銀鮭子代親權鑒定的對數(shù)優(yōu)勢比(Logarithm of odds, LOD)值，由圖2可見，所有子代樣本的檢測結果都落在可靠象限內。

2.5 基于低通量SNP芯片的養(yǎng)殖群體遺傳結構分析

基于鮭鱒通用型低通量 SNP芯片分型數(shù)據(jù)，應用 Structure軟件對來自國內 4個代表性鮭鱒養(yǎng)殖群體的32尾個體開展遺傳結構分析。圖3展示了假定祖源群體數(shù)(K)分別為2和4時的Structure遺傳結構圖，圖中不同顏色代表不同的祖源成分。

表2 鮭鱒通用型低通量SNP芯片位點遺傳多態(tài)性統(tǒng)計Tab.2 Genetic polymorphism of markers in the salmonid 96 SNP array

K=2的假設下，所有樣本以屬為分類階元進行聚類，而K=4的假設下，樣本以種為分類階元進行聚類。每尾樣本中占主導地位的遺傳組分與個體所屬的分類階元相符，同時包含少量其他遺傳組分，2組分析結果都顯示，銀鮭樣本 OK2、OK7，山女鱒樣本OM1、OM7，美洲紅點鮭樣本SF8、白斑紅點鮭樣本SL2、SL6為非主導遺傳組分占比較高的個體。

3 討論

各種鮭科魚類物種間親緣關系較近，基因組序列相似性較高，因而具有大量共享的分子標記。梁利群等(2004)從50個虹鱒微衛(wèi)星標記中篩選出12個在黑龍江烏蘇里白鮭(Coregonus ussuriensis)自然群體中具有多態(tài)性的標記用于遺傳多樣性分析。魯翠云等(2016)從150個虹鱒微衛(wèi)星標記中篩選出48個在白斑紅點鮭養(yǎng)殖群體中具有多態(tài)性的標記，并開展了群體遺傳結構分析。目前，虹鱒的全基因組測序已經完成，并開發(fā)了多種通量的SNP分型芯片等遺傳分析工具，建立了基于基因組信息的現(xiàn)代化育種、育苗體系。本研究基于這些新開發(fā)的虹鱒基因組信息資源，開展了共享標記篩查，使用虹鱒高通量 SNP芯片，在國內代表性鮭鱒養(yǎng)殖群體中對 57,501個標記進行了分型檢測。

圖3 國內4個代表性鮭鱒養(yǎng)殖群體遺傳結構分析Fig.3 Structure analysis for 4 representative salmonid populations in China

結果顯示，在跨物種檢測中，標記分型成功比例和多態(tài)比例都明顯低于虹鱒樣本。在相同的質控標準(CR > 97%)下，該芯片在不同虹鱒群體中的分型位點數(shù)為49,299～49,468個(Paltiet al, 2015)，而在其他鮭鱒養(yǎng)殖物種中的分型位點數(shù)僅為37,926～42,658個；各虹鱒群體中多態(tài)性位點比例在 21.5%～92.8%范圍內波動(Paltiet al, 2015)，而在其他鮭鱒養(yǎng)殖群體中的多態(tài)性位點比例僅為9.01%～45.99%。但由于SNP標記的總量巨大，基因組覆蓋度高，在基因組編碼區(qū)和非編碼區(qū)都有大量分布，這些物種間共享的 SNP仍能提供較為豐富的遺傳多態(tài)信息，鯉高通量 SNP芯片也曾被成功應用于鯽(Carassius auratus)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)等8種近緣魚類遺傳分析中(Xuet al, 2014)。由表1可見，跨物種分型成功位點數(shù)目與目標物種間的親緣關系相關，山女鱒、銀鮭與虹鱒同屬于大麻哈魚屬，親緣關系較近，因此，分型位點數(shù)略高于美洲紅點鮭和白斑紅點鮭；而多態(tài)性位點數(shù)目主要取決于群體本身的遺傳多樣性，雖然銀鮭與虹鱒親緣關系更近，但其多態(tài)位點比例遠低于與虹鱒親緣關系較遠的美洲紅點鮭，表明采樣的銀鮭群體遺傳多樣性較低，亟待改善。

Fluigidm低通量分型平臺有48.48和96.96兩種芯片，分別適用于48和 96個位點的同時分型。Xu等(2017)使用48.48芯片構建了鯉(Cyprinus carpio)低密度 SNP芯片，該芯片在用于家系親權鑒定時的準確率為94%。Liu等(2016)構建虹鱒低密度SNP芯片則使用了96.96芯片，結果表明，當使用其中68個位點開展家系親權鑒定時，結果準確率為 100%，僅使用48個位點時，準確率為 99.2%，當位點數(shù)下降到 36個時，準確率降至 92.5%。Harlizius等(2011)就 SNP芯片在杜洛克豬商品群體親權鑒定中的應用開展過更為細化的統(tǒng)計分析，當候選親本中僅包含真實親本(n=66)時，60個SNP位點即可實現(xiàn)100%準確的親權鑒定，而當候選親本中混入了大量干擾個體(n=304)時，則需要80個SNP位點來實現(xiàn)100%準確的親權鑒定。鑒定的準確性受到子代樣本數(shù)目、候選親本數(shù)目，以及群體遺傳結構、分型位點在群體中的多態(tài)性等多種因素影響，而本研究試圖構建多物種通用的 SNP芯片，還需要考慮部分位點可能在待測物種或群體中分型失敗的可能性，因此，采用96.96芯片，通過檢測略高于必要數(shù)目的 SNP位點，來保障分析結果的可靠性。

本研究經過高通量SNP芯片分型篩查，獲得4個鮭鱒養(yǎng)殖群體共享的多態(tài)性標記共89個，涵蓋了大麻哈魚屬和紅點鮭屬各2個物種，推測這些位點在鮭科常見養(yǎng)殖物種中都具有較高的通用性，可以作為鮭鱒通用型SNP芯片構建的候選位點。考慮到共享位點篩查所用的銀鮭群體遺傳多樣性較低，可能導致多態(tài)性位點發(fā)掘不充分，從其他3個群體共享的多態(tài)性位點中選取了補充位點，補足96個位點用于芯片構建。

為了驗證所構建的低通量 SNP芯片分型結果準確性，使用該芯片對高通量SNP芯片檢測過的32尾樣本進行了重復檢測，結果一致性為 96.55%，不一致的位點主要表現(xiàn)為分型失敗，結果缺失。由此可見，F(xiàn)luidigm低通量 SNP芯片在鮭鱒樣本檢測中的分型準確性較高。

高通量芯片分型結果顯示，OK1～8樣本所屬的銀鮭群體遺傳多樣性不足，因此，在低通量芯片樣本選擇時，從另一個銀鮭養(yǎng)殖群體中采集了親本及子代樣本共計 64尾，即 OK9～72，以驗證該芯片在銀鮭中的適用性。分型結果顯示，初篩銀鮭群體中不具有多態(tài)性的17個位點中，有12個在新的銀鮭樣本中表現(xiàn)出多態(tài)性，證明芯片的位點選擇是成功的，入選位點在鮭科不同物種中均具有較高的多態(tài)性。

虹鱒低通量芯片的研究結果顯示(Liuet al,2016)，在用于親權鑒定時，Cervus軟件的準確率略高于其他同類軟件。將同批次分型的其他鮭鱒樣本均作為候選親本，應用Cervus 3.0.7軟件開展親權鑒定，結果表明，基于該芯片分型結果能夠準確重現(xiàn)復雜家系的真實系譜。親權鑒定的準確性通過LOD值來反映，表示假設為真與假設為假的概率之比的 Log10對數(shù)值，當LOD值為0時，假設成立的概率為50%，當LOD為正值時，認為假設成立，即存在親子關系。由圖2可見，多數(shù)子代個體與軟件預測的親本間配對或配組的LOD值均遠大于零，特別是雙親鑒定時，所有配組的LOD值均高于18以上，表明親權鑒定結果準確性很高。

除系譜鑒定外，該芯片還能夠應用于群體遺傳資源分析，如圖3中的示例，基于96個SNP位點的基因頻率分布，反映群體間的遺傳組分構成和遺傳關系，篩查群體內部具有獨特遺傳組成的離群個體。在水產養(yǎng)殖業(yè)中，準確的系譜鑒定為科學制種和育種方案的規(guī)劃奠定了基礎(李東宇等, 2016)，基于分子標記的群體遺傳分析還可應用于種質資源評估(王軍等,2018)、增殖放流效果評估(司飛等, 2017)等多個領域，因此，本研究構建的鮭鱒通用型低密度 SNP具有較為廣泛的應用前景，能夠為鮭鱒制種、育種和引種等科學決策提供基因組信息參考。