不同種類浮游植物對CO2濃度升高的響應*

馬 莎 張繼紅 劉 毅 吳文廣 孫 科 王 巍 隋娟娟 趙云霞 楊艷云

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3.青島海洋科學與技術試點國家試驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

海水酸化是由全球氣候變化導致的一種海洋環(huán)境變化，已成為一個世界性的環(huán)境問題和當今的研究熱點(Riebesellet al, 2007)。關于海水酸化對浮游植物的生長、光合作用、葉綠素熒光動力學參數(shù)的影響已有報道(高坤山, 2011； 毛雪微等, 2016； 徐金濤等,2016； Honget al, 2017)，但由于海洋藻類對大氣CO2濃度升高的響應存在明顯的種間異質(zhì)性，不同種類浮游植物，甚至同一種類在不同培養(yǎng)條件下對酸化的響應均不同。同時，浮游植物作為濾食性貝類的主要餌料，其營養(yǎng)價值取決于被攝食的難易程度(粒徑的大小)和生化組成等(陳自強等, 2013)，而生物體發(fā)育過程中大分子的組成及其化學計量的變化都會反映到元素比率上(Laspoumadereset al, 2010； 陳蕾等,2014)，浮游植物的元素組成會影響其營養(yǎng)物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂肪酸等)的含量(Sterneret al, 2002)，進而影響其作為食物的營養(yǎng)價值。關于海水酸化對不同種類浮游植物生物組成的研究較少(Rossollet al, 2012；Schooet al, 2013)，因此，開展CO2濃度升高對不同類別餌料藻細胞數(shù)量(生長、光合)和質(zhì)量(營養(yǎng)元素含量比值)影響的比較研究是非常必要的。本研究采用室內(nèi)可控實驗方法，以不同粒徑、不同種類的4種餌料藻：叉鞭金藻(Dicrateriasp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)為研究對象，測定了CO2濃度升高對其生長、單位細胞葉綠素a含量、葉綠素熒光動力學參數(shù)及營養(yǎng)質(zhì)量的影響，以期為進一步從食物鏈角度研究海水酸化對濾食性貝類及海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

實驗所用藻種叉鞭金藻、三角褐指藻、小球藻和亞心形扁藻，均由中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖生態(tài)與技術研究室提供。

實驗設定低 CO2濃度組(403×10-6)和高 CO2濃度組(1600×10-6)，相當于當前和 2300年大氣平均 CO2濃度預測水平(Caldeiraet al, 2003； Stockeret al, 2013；Dlugokenckyet al, 2017)。CO2濃度采用植物培養(yǎng)箱(HP1000G-D, 武漢瑞華儀器設備有限責任公司)來控制(毛雪微等, 2016)。實驗所用容器為3 L錐形瓶，加入2 L f/2培養(yǎng)液，接入指數(shù)生長期的微藻，初始濃度為5～10×104cells/ml。每個實驗組分別設置3個平行，初始 pH為8.2和7.6。光暗比(L/D)為 12 h∶12 h，溫度為(20.0±0.5)℃，光照為 80 μmol/(m2·s)，每天定時搖動4～6次。實驗持續(xù)13 d，每隔1 d測定藻細胞濃度和藻體的葉綠素熒光參數(shù)，培養(yǎng)7 d后測定藻體的C、N和P含量。葉綠素a含量按照海洋監(jiān)測規(guī)范GB 17378.7-2007進行。

1.2 藻細胞濃度計數(shù)及比生長速率計算

取樣10 ml，用Beckman Coulter Multisizer Ⅲ顆粒計數(shù)器測定藻細胞濃度。根據(jù)以下公式計算比生長速率(μ)：

式中，N1為第t1天藻細胞密度(cell/ml)；N2為第t2天藻細胞密度。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)測定

利用 Imaging-PAM 調(diào)制葉綠素熒光成像系統(tǒng)對藻進行葉綠素熒光動力學參數(shù)的測定。測量前將浮游植物樣品暗適應 20 min，每個平行重復 2次。采用Platt等(1980)提出的雙指數(shù)衰減函數(shù)對快速光曲線(RLC)進行擬合：

其中，P為相對電子傳遞速率，Pm為無光抑制時的最大潛在相對電子傳遞速率rETRmax，PAR為光照強度，α為快速光曲線的初始斜率，β為光抑制參數(shù)。

1.4 C、N和P含量測定

取一定體積的藻液，離心收集(3000 r/min 10 min)，烘干至恒重。將樣品研磨成粉狀混合均勻，取2 mg用元素分析儀(Elemental Analyzer Vario EL cube, 德國Elementar)測定藻體 C、N 含量；按照周毅等(2003)方法測定藻體P含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 21.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗組間組內(nèi)差異，P＜0.05視為差異顯著，P＜0.01視為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 4種浮游植物細胞生長及比生長速率

不同CO2濃度下亞心形扁藻、小球藻、叉鞭金藻和三角褐指藻的生長曲線以及比生長速率如圖 1所示?？傮w來講，CO2濃度升高可顯著提高4種藻的生長及比生長速率(P＜0.05)，但不同種類的變化幅度不同。從比生長速率來看，亞心形扁藻的反應最為迅速，與對照組相比，差異達到極顯著(P＜0.01)，其最大比生長速率為0.590/d，整個實驗期間平均比生長速率(0.233/d)比對照組(0.205/d)高出13.5%；同時，高 CO2濃度組的藻體細胞濃度顯著高于低 CO2濃度組(圖1a)(P＜0.05)。其次是小球藻，在培養(yǎng)的第3天，藻細胞濃度顯著高于對照組(P＜0.05)，平均比生長速率相比低CO2濃度組提高了5.9%(圖1b)。叉鞭金藻和三角褐指藻在培養(yǎng)的第9天，高CO2濃度組的藻細胞濃度顯著高于低CO2濃度組(P＜0.05，圖1c、圖1d)。從藻體細胞濃度來看，亞心形扁藻和三角褐指藻分別在第11天和第9天達到峰值，之后增長減緩；小球藻和叉鞭金藻在實驗結(jié)束的第13天尚處于指數(shù)增長期。

2.2 藻體C、N和P元素含量及其比值

不同CO2濃度下4種藻體的C、N、P含量及其比值見表1?？傮w趨勢是，CO2濃度升高提高了4種藻藻體的 C含量，其中小球藻達到了顯著水平(P＜0.05)；高CO2濃度下，4種藻藻細胞N含量均出現(xiàn)降低趨勢，其中，僅亞心形扁藻的N含量顯著降低(P＜0.05)，其他3種藻N含量變化不顯著(P＞0.05)；不同藻藻體的P含量變化趨勢不同，亞心形扁藻和小球藻高CO2濃度組顯著低于低 CO2濃度組(P＜0.05)，但叉鞭金藻和三角褐指藻P含量變化不顯著(P＞0.05)。

圖1 不同CO2濃度下4種藻的生長曲線和比生長速率Fig.1 Growth curves and the specific growth rate of four microalgae cultured in different CO2 concentrations

表1 4種藻在不同CO2濃度下培養(yǎng)7 d后藻體C、N、P含量及其比值Tab.1 C, N and P contents and mole ratios in microalgae cultured with different CO2 concentrations in 7 days

CO2濃度升高使藻體的C/N升高，其中，亞心形扁藻和三角褐指藻 C/N值顯著提高(P＜0.05)，分別從8.16增加至9.89，從10.29增加至13.83；C/P的種間差異較大，亞心形扁藻和小球藻高CO2濃度組顯著高于低 CO2濃度組(P＜0.05)，叉鞭金藻和三角褐指藻與低CO2濃度組無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 CO2濃度升高對4種藻類光合作用參數(shù)的影響

2.3.1 單位細胞葉綠素a含量的變化 4種藻的單位細胞葉綠素a含量隨時間變化情況見圖2。在整個培養(yǎng)期間(13 d)，除小球藻外，其他3種藻高CO2濃度組的單位細胞葉綠素a含量均呈現(xiàn)降低趨勢。亞心形扁藻和叉鞭金藻分別在培養(yǎng)的第3天和第7天顯著低于低CO2濃度組，其中，亞心形扁藻在實驗后期又逐漸升高，與低 CO2濃度組相比差異達到顯著程度(P＜0.05)；小球藻單位細胞葉綠素a含量在第3天顯著提高；而 CO2濃度升高對三角褐指藻無顯著影響(P＞0.05)。

圖2 不同CO2濃度下4種藻單位細胞葉綠素a含量Fig.2 The chlorophyll a contents of four microalgae cultured in different CO2 concentrations

2.3.2 葉綠素熒光參數(shù) 4種藻葉綠素熒光參數(shù)隨時間變化情況見圖3。亞心形扁藻Fv/Fm的變化范圍為 0.581～0.703(圖3a)，前11 d高CO2濃度組與低CO2濃度組無顯著差異，之后顯著下降(P＜0.05)；非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)在第 11天，高 CO2濃度組顯著低于低 CO2濃度組(P＜0.05)；光化學淬滅(qP)無顯著變化(P＞0.05)。CO2濃度升高對小球藻 NPQ 和qP均無顯著影響(圖3b)；Fv/Fm在第7天顯著高于對照組(P＜0.05)，其變化范圍在0.552～0.656之間。對于叉鞭金藻，高CO2濃度條件下的Fv/Fm和qP與低CO2濃度組無顯著差異；NPQ顯著低于低 CO2濃度組(P＜0.05)(圖 3c)。三角褐指藻Fv/Fm變化趨勢與叉鞭金藻一致，數(shù)值變化范圍在0.482～0.662之間，高CO2濃度組在第 3、5、13天顯著高于低 CO2濃度組(P＜0.05)；高 CO2濃度組 NPQ 在第 11天顯著升高(P＜0.05)；qP先緩慢降低后趨于平穩(wěn)，在第7天和第13天高CO2濃度組qP顯著高于低CO2濃度組(P＜0.05)(圖 3d)。

2.3.3 指數(shù)生長期快速光曲線擬合參數(shù) 4種藻的潛在最大相對電子傳遞效率(rETRmax)、快速光曲線初始斜率(α)見圖4。高CO2濃度條件下，亞心形扁藻和三角褐指藻的 rETRmax顯著提高(P＜0.05)，小球藻、叉鞭金藻無顯著差異(P＞0.05)；CO2濃度升高對亞心形扁藻、小球藻、三角褐指藻的快速光曲線初始斜率(α)無顯著影響(P＞0.05)，叉鞭金藻的α顯著高于低CO2濃度組(P＜0.05)。

圖3 不同CO2濃度下4種微藻不同熒光參數(shù)的變化Fig.3 Changes of different fluorescence parameters of four microalgae cultured in different CO2 concentrations

圖4 4種藻快速光曲線擬合參數(shù)rETRmax和α隨培養(yǎng)時間的變化Fig.4 Variations of rETRmax and α of the four microalgae with culturing time

3 討論

3.1 不同藻類細胞數(shù)量對海水酸化的響應

不同種類浮游植物對 CO2濃度升高的響應存在較大差異。本研究中，CO2濃度升高顯著促進了叉鞭金藻、三角褐指藻、亞心形扁藻和小球藻種群的生長。毛雪微等(2016)的研究顯示，酸化會促進浮游植物的生長，CO2濃度升高(1000 μatm CO2)使三角褐指藻實驗組的平均比生長速率比對照組高出 33.1%，高于本研究的結(jié)果。導致這種差異的原因可能是酸化程度和光照等實驗條件不同。已有的研究結(jié)果顯示，三角褐指藻的最適光照強度為144 μmol/(m2·s)，在一定范圍內(nèi)，藻體的生長速率隨光照強度的增加而增加(臧正蓉等,2015)，而毛雪微等(2016)的報道中光照強度為(139±20) μmol/(m2·s)，本研究光照強度為 80 μmol/m2·s?？梢姴煌∮沃参飳O2濃度升高的響應程度不同。哪種浮游植物會在高CO2濃度下成為競爭優(yōu)勢種，還與自然海域的其他環(huán)境條件有關。因此，僅憑室內(nèi)的單種培養(yǎng)結(jié)果，不足以預測自然海域浮游植物種群及群落結(jié)構(gòu)對CO2濃度升高的響應。

葉綠素熒光技術是一種研究和探測植物光合生理狀況及各種外界因子對其細微影響的新型植物活體測定技術，是快速、無損傷地研究植物光合作用的理想方法。葉綠素熒光參數(shù)與光合作用中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配等反應緊密相連(姜恒等, 2012)。Fv/Fm是藻類生理狀態(tài)的重要指標，當浮游植物受到光照、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子脅迫時，F(xiàn)v/Fm通常會顯著降低(梁英等, 2007； 高坤山,2014)。本研究中，4種藻的Fv/Fm值在CO2濃度升高條件下(培養(yǎng)的前7 d內(nèi))并未顯著降低，且小球藻和三角褐指藻分別在第7天和第3天、第5天顯著增加，說明高CO2濃度并未造成脅迫，同時提高了小球藻和三角褐指藻的最大光和效率。NPQ為非光化學淬滅系數(shù)，反映 PSⅡ天線色素吸收的光能以熱的形式耗散的那部分能量，目的是緩解過剩的激發(fā)能對 PSⅡ反應中心的破壞，是一種自我保護機制(梁英等,2007)。本研究中，亞心形扁藻高CO2濃度組的NPQ在第3天顯著降低，叉鞭金藻高CO2濃度組NPQ除第5天外均顯著低于低CO2濃度組，類似情況在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)：在高pCO2水平(101.3 Pa)下，三角褐指藻 NPQ與對照(39.3Pa)相比顯著降低(Wuet al,2010)，這可能是由于當前海洋環(huán)境下存在叉鞭金藻的碳源供應限制(王東升, 2015)。qP是光化學淬滅，反映 PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額。三角褐指藻高CO2濃度組qP在第7天、第13天顯著增加，PSⅡ的電子傳遞活性增強，光合活性升高。α表示藻類對光能的利用效率，CO2濃度升高顯著提高了指數(shù)生長期叉鞭金藻α值，與徐金濤等(2016)研究的塔瑪亞歷山大藻的結(jié)果不一致。分析原因，可能與藻體的種間差異、實驗條件不同等有關。徐金濤等(2016)實驗培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，光照強度為 120 μmol/(m2·s)，pH 為 8.0±0.1，與本實驗條件略有差異?？梢?，不同藻的葉綠素熒光參數(shù)對CO2濃度升高的響應不同，其中除了小球藻葉綠素熒光參數(shù)沒有顯著差異外，CO2濃度升高引起的酸化環(huán)境對其他3種藻的葉綠素熒光參數(shù)均有不同程度的影響，敏感程度各不一致。

浮游植物光合作用的強弱是影響其種群生長速率的主要因素。色素含量高低與藻細胞光合作用強弱有直接的關系，也間接影響細胞的生長繁殖(梁英等,2007)，其中葉綠素a是海洋浮游植物中除藍藻以外均含有的特征色素(徐金濤等, 2016)，因此，CO2濃度升高對藻體葉綠素熒光參數(shù)及葉綠素a含量產(chǎn)生的影響，最終表現(xiàn)為對浮游植物細胞生長的影響。高CO2濃度條件下，亞心形扁藻和小球藻分別通過增強rETRmax和升高單位細胞葉綠素a含量來促進細胞數(shù)量的增加。同時，CO2濃度升高加快了叉鞭金藻的電子傳遞速率，增強了對光能的吸收能力，并提高了三角褐指藻的潛在最大光合作用能力，促進了細胞生長。浮游植物的光合作用是一系列復雜代謝反應的總和，CO2濃度升高對其光合作用過程及生長的具體影響機制還有待今后進一步研究。

3.2 CO2濃度升高引起的海水酸化對不同藻類質(zhì)量的影響

自然環(huán)境中海洋浮游植物 C、N、P比值趨近于106 ：16 ：1(Redfield, 1934)，但由于浮游植物可有效利用的N、P濃度存在很大差異，加之光強、溫度和CO2濃度等變化，導致很多藻類的 C、N、P比不同于 Redfield 比值(Fuet al, 2007； Finkelet al, 2010)。本研究結(jié)果顯示，CO2濃度的增加提高了亞心形扁藻的C/N、C/P值、小球藻的 C/P值和三角褐指藻的C/N值，藻體中N、P含量相對減少，偏離了Redfield比值，使其作為食物的營養(yǎng)價值降低。藍細菌聚球藻(Synechococcus)是海洋浮游植物群落的優(yōu)勢組分，是全球碳循環(huán)的主要參與者和初級生產(chǎn)力的主要貢獻者，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的光合作用、碳循環(huán)及食物鏈中扮演著舉足輕重的角色(馬英等, 2004)。Fu等(2007)對藍細菌聚球藻的研究顯示，在 CO2濃度升高(750×10-6)的條件下，C、N含量、C/P值均升高，與本研究結(jié)果一致。Urabe等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度增加提高了浮游植物C/P值，使其作為食物的質(zhì)量下降，進而對水溞的生長產(chǎn)生抑制作用。在 N、P限制條件下培養(yǎng)的餌料微藻C/N、C/P比值升高，營養(yǎng)價值發(fā)生了變化，使安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomus annandalei)各時期個體的N、P含量顯著降低，對其生長發(fā)育和攝食均產(chǎn)生了抑制作用(石琛等, 2011； 何學佳等,2012)。CO2濃度升高對浮游植物C、N、P比值的影響會沿食物鏈向上傳遞，使得植食性動物，如浮游動物、濾食性貝類等的食物品質(zhì)下降，對浮游動物、濾食性貝類等次級生產(chǎn)者的生長發(fā)育、生殖等產(chǎn)生一系列影響，進而影響整個食物網(wǎng)(Rossollet al, 2012；陳蕾等, 2014)。由于種間異質(zhì)性，不同藻類對 CO2濃度升高的響應不同，今后應該加強對不同種類的研究，并結(jié)合現(xiàn)場實驗等(高坤山, 2011； 陳蕾等,2014)，綜合探討氣候變化對食物鏈及海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響。