甘藍型油菜光敏色素互作因子4 (BnaPIF4)基因克隆和功能分析

馮 韜 官春云

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甘藍型油菜光敏色素互作因子4 (BnaPIF4)基因克隆和功能分析

馮 韜 官春云*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家油料改良中心湖南分中心, 湖南 長沙 410128

光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4, PIF4)是光信號途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子, PIF4與BZR互作介導(dǎo)光信號與油菜素內(nèi)酯信號互作, 參與植物光響應(yīng)。本文在甘藍型油菜湘油15號中克隆到2個基因, 分別定位于A03號染色體和C03號染色體, 命名為和, 全長編碼序列(coding sequence, CDS)、全長mRNA和全長基因分別為1242 bp和1245 bp、1701 bp和1731 bp、2527 bp和2665 bp, 各自編碼413和414個氨基酸。具有7個外顯子和6個內(nèi)含子,具有8個外顯子和7個內(nèi)含子, 與測序品種中雙11號相比,基因第1內(nèi)含子存在單堿基插入突變, 第4和第6內(nèi)含子存在缺失突變, 且具有更長的3'-UTR, 兩基因其他序列在湘油15號和中雙11號之間無差別。和基因編碼蛋白具有典型的植物bHLH結(jié)構(gòu)域, 亞細胞定位于細胞核, 是典型的植物PIF4蛋白。多序列比對和進化分析表明, BnaPIF4蛋白與白菜、擬南芥、亞麻芥等PIF4蛋白高度同源。PIF4蛋白進化關(guān)系與物種進化關(guān)系一致, 近緣物種中的PIF4蛋白在進化樹中高度聚類, 大量植物中可見PIF4蛋白重復(fù)且低等植物中分化程度明顯低于高等植物中, 表明PIF4蛋白是一個晚期進化事件且可能存在功能冗余。酵母雜交實驗表明BnaPIF4與BnaBZR蛋白存在互作, 但BnaPIF4不能與基因的啟動子互作, 表明與在蛋白水平而非轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生互作。湘油15號中和基因表達規(guī)律一致,基因主要表達于油菜莖表皮、未成熟角果和葉中, 在花和根中表達較低, 且其表達隨油菜生育進程逐漸降低。

甘藍型油菜; 光敏色素互作因子4; 基因克隆; 基因互作; 基因表達; 生物信息學(xué)分析

低光寡照影響甘藍型油菜結(jié)實, 是造成油菜減產(chǎn)的重要原因之一[1], 增強油菜對低光脅迫的抗性是生產(chǎn)上面臨的重要議題。低光如何影響油菜產(chǎn)量尚無明確的機制研究, 光信號通過何種轉(zhuǎn)化最終影響油菜產(chǎn)量形成尚不明確。有研究顯示施用外源油菜素內(nèi)酯可以增強番茄[2]、水稻[3]等多種作物光合效率、增強弱光抗性、增加產(chǎn)量, 過表達油菜素內(nèi)酯合成基因增強甘藍型油菜非生物脅迫抗性和產(chǎn)量[4], 表明光信號途徑與油菜素內(nèi)酯信號途徑的互作可能是光最終影響油菜產(chǎn)量的原因之一。在擬南芥和水稻中均證實光敏色素互作因子4 (phytochrome interacting factor 4, PIF4)與蕓薹素唑抗性因子(brassinazole-resistant, BZR/BES)互作介導(dǎo)光信號途徑與油菜素內(nèi)酯信號途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5], 對甘藍型油菜基因及其與互作的相關(guān)研究是闡明弱光脅迫對油菜產(chǎn)量影響的關(guān)鍵問題之一, 作者前期工作中已克隆了甘藍型油菜基因,本文主要關(guān)注甘藍型油菜基因相關(guān)研究。

PIFs屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族第15亞家族, 具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域可自結(jié)合形成同源二聚體或與含有HLH結(jié)構(gòu)域的其他蛋白形成異源二聚體參與光、溫、激素等響應(yīng)的下游基因表達調(diào)控[6]。PIF4是PIFs家族中重要成員, 是植物光信號途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子之一, 最早發(fā)現(xiàn)其負調(diào)控光敏色素B信號參與擬南芥光質(zhì)響應(yīng)過程[7]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)PIF4不僅參與光質(zhì)響應(yīng), 同樣對光強和溫度響應(yīng)[8], PIF4與光敏色素B互作調(diào)控光子總量影響的擬南芥氣孔發(fā)育[9], 調(diào)控光敏色素合成介導(dǎo)高溫脅迫下藍光響應(yīng)[10], 對生長素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等多種植物激素信號調(diào)控或互作。PIF4在高溫脅迫下, 通過調(diào)控上游基因轉(zhuǎn)錄影響生長素合成[11], 通過與DELLA互作影響赤霉素的合成與功能發(fā)揮[12], 油菜素內(nèi)酯與PIF4則存在雙向關(guān)系, 一方面PIF4通過與BZR/BES互作影響油菜素內(nèi)酯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo), 另一方面油菜素內(nèi)酯依賴的磷酸化影響基因轉(zhuǎn)錄, 調(diào)控PIF4水平[13]。弱光脅迫下, 菊花基因表達出現(xiàn)先升高后趨穩(wěn)緩降的規(guī)律, 乙烯、赤霉素和生長素等激素水平同時發(fā)生變動, 表明PIF4可能參與植物對弱光脅迫的響應(yīng)[14]。

甘藍型油菜為異源多倍體, 基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 測序完成較晚[15], 因此相關(guān)基因功能研究滯后, 目前對甘藍型油菜中的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 以及與其他激素途徑之間的互作尚不明確, 信號途徑中關(guān)鍵基因的解析不足, 導(dǎo)致相關(guān)基因在育種中的應(yīng)用受限。

本文通過甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中基因序列設(shè)計引物, 從甘藍型油菜品種湘油15號中克隆獲得2個基因的編碼序列(coding sequence, CDS)、全長mRNA和全長基因序列, 染色體步移證實一個位于A03染色體, 一個位于C03染色體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜(L.)雙低品系湘油15號由國家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 RNA提取與cDNA合成

湘油15號種子在22℃、光周期為16 h/8 h條件下培養(yǎng)至2片真葉, 取幼苗50~100 mg。加液氮充分研磨后, 使用TRIzol RNA提取試劑盒(TransGen生物技術(shù)有限公司), 按說明書所示方法提取總RNA, 以此RNA為模板, 使用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(TransGen生物技術(shù)有限公司)按說明書所示方法合成第1鏈cDNA。

1.3 DNA提取

取1.2所述湘油15號葉片50~100 mg, 液氮研磨后加入1 mL CTAB-PVP buffer, 提取總DNA備用于目標(biāo)基因全長序列和啟動子序列的克隆。

1.4 BnaPIF4基因的克隆及序列分析

從BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)甘藍型油菜全轉(zhuǎn)錄組中提取的轉(zhuǎn)錄本序列。分析比對, 設(shè)計含起始密碼子的5'端引物和含有終止密碼子的3'端引物(湖南擎科生物技術(shù)有限公司合成), 用于CDS克隆; 根據(jù)CDS測序比對結(jié)果, 檢索全長mRNA和全長基因并設(shè)計克隆引物。CDS克隆引物為: BnaPIF4-F: 5'-ATGGAACACCAAGGTTGGAG-3', BnaPIF4-R: 5'-CTAACGGGGACCGTCGGT-3';邊界序列一致, mRNA克隆與全長基因克隆共用引物對為: dPIF4-F: 5'-TCTGTCTGTACCAAAAGAAG-3', dPIF4-R: 5'-TCTGGACGATTATGAAAAGC-3'; 分別以1.2所述cDNA和1.3所述DNA為模板進行PCR擴增。PCR體系含50 ng μL–1模板1 μL、10 mmol L–1dNTPs 0.5 μL、2 μmol L–1BnaPIF4-F/mPIF4-F 0.75 μL、2 μmol L–1BnaPIF4-R/mPIF4-R 0.75 μL、10×反應(yīng)緩沖液1 μL、GXL高保真DNA聚合酶0.5 μL和ddH2O 15.5 μL。擴增程序為預(yù)變性95℃ 5 min; 95℃50 s, 58℃45 s, 72℃ 3 min, 35個循環(huán); 72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測和記錄結(jié)果。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體(TransGen生物技術(shù)有限公司)連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans1-T1 (北京天根生化有限公司), 篩選陽性克隆進行基因測序, 通過BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)對獲得的克隆序列進行染色體步移分析, 隨后使用DNAman對克隆獲得的基因拷貝進行序列比對。

1.5 BnaPIF4蛋白生物信息學(xué)分析

1.5.1 BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03氨基酸序列特征與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過ANTHEPROT 6.2軟件分析來源于甘藍型油菜的和基因所編碼的蛋白質(zhì)。統(tǒng)計編碼蛋白的氨基酸殘基組分、分析等電點、特異性識別序列和親疏水特征并使用Gariner模型進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用wolf-pSORT (https://www.genscript.com/tools/ wolf-psort)和Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu. cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)進行亞細胞定位預(yù)測。

1.5.2 BnaPIF4蛋白同源結(jié)構(gòu)域分析 使用DNAman對BnaPIF4蛋白進行序列比對分析; 同時使用NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分別對不同的BnaPIF4蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析; 使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)、MOTIF (http://www.genome.jp/tools/motif/)以及InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析BnaPIF4包含的特殊結(jié)構(gòu)域。

1.5.3 PIF4蛋白聚類分析 通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein), String數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de/), PDB數(shù)據(jù)庫(http://www. pdb.org/pdb/home/home.do)檢索來源于不同物種的PIF4蛋白序列, 并使用MEGA6.0對來源不同的PIF4相關(guān)蛋白進行聚類分析。

1.6 BnaPIF4互作因子酵母雜交分析

使用、和載體(本實驗室保存),氨基酸合成缺陷酵母進行酵母單雙雜交實驗, 分析BnaPIF4與BnaBZR1/BnaBES1互作模式。、和基因的CDS分別亞克隆到載體上;各拷貝CDS亞克隆到載體; 從湘油15號gDNA中克隆、和基因啟動子(起始密碼子上游1 kb序列), 隨后將各啟動子序列亞克隆到pHIS2載體上; 隨后分別將不同組合的AD與BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母并接種到添加濃度10 mmol L-13-AT的三缺培養(yǎng)基進行篩選, 用于驗證BnaPIF4蛋白與BnaBZR1BnaBES1/2蛋白以及啟動子之間的互作關(guān)系。

1.7 甘藍型油菜中BnaPIF4_A03和BnaPIF4_ C03基因時空表達分析

以1.2方法提取甘藍型油菜湘油15號不同時期根、莖、葉、花和角果皮總RNA, 使用寶生物工程(大連)有限公司PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄, 獲得cDNA第1鏈作為qRT-PCR模板。分析1.4中克隆獲得的片段, 根據(jù)5'-UTR序列特征設(shè)計兩基因分型定量引物如下: PIF4A03-F: 5'-AAGTAAA GAACCTTACCCATCT-3', PIF4A03-R: 5'-TAAAGTT CCACGCCCAAA-3'; PIF4C03-F: 5'-AATCATTATCT CCCTCGCTGTA-3', PIF4C03-R: 5'-TGAAGTTCCA CGCCCA AC-3'。以作為內(nèi)參基因, 內(nèi)參引物為BnUBC21-F: 5'-CCTCTGCAGCCTCCTCAA GT-3', BnUBC21-R: 5'-TATCTCCCCTGTCTTGAAA TGC-3', 用于和時空表達分析, 每樣品進行3次重復(fù)。在ABI 7500熒光定量PCR系統(tǒng)上運行qRT-PCR。PCR體系包含1 μL cDNA、10 μL 2×FastStart Universal SYBR GreenMaster with ROX、10 μmol L–1正向引物和反向引物各0.5 μL、8 μL ddH2O。PCR程序為95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 32 s, 35個循環(huán)。反應(yīng)完成后進行95℃ 20 s, 60℃ 20 s, 95℃ 20 s, 59℃ 20 s繪制熔解曲線檢測擴增產(chǎn)物的正確性和引物二聚體。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnaPIF4基因克隆

以湘油15號cDNA為模板, 克隆到2個CDS序列(圖1-A), 長度分別為1242 bp和1245 bp, 對應(yīng)的克隆到2個基因全長mRNA (圖1-B)分別為1701 bp和1731 bp, 以湘油15號gDNA為模板克隆得到對應(yīng)基因的全長序列(圖1-C)為2527 bp和2665 bp, 分別定位于A03和C03染色體, 命名為和。通過BRAD數(shù)據(jù)庫比對, 確認2個CDS、mRNA和基因全長DNA序列的完整性, 對BRAD數(shù)據(jù)庫檢索未發(fā)現(xiàn)更多的基因拷貝, 表明和克隆完整。序列比對顯示和基因的CDS相似度98.15%, mRNA相似度92.82%, 基因全長相似度94.64%, 表明和基因高度同源, 且基因序列變異主要發(fā)生在UTR區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域。仔細分析和基因各序列, 并繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖(圖2)。

圖1 BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因克隆

A: 編碼序列; B: mRNA; C: 基因全長: M1: 2K DNA 標(biāo)記; M2: 2K plus DNA標(biāo)記; 1:: 2:。

A: CDS; B: mRNA; C: Full length gene; M1: 2K DNA marker; M2: 2K plus DNA marker; 1:; 2:.

圖2 BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03基因結(jié)構(gòu)

序列分析顯示,基因序列與測序品種中雙11號中一致, 存在8個外顯子和7個內(nèi)含子, CDS序列位于第3~8外顯子;基因具有7個外顯子和6個內(nèi)含子, 但序列與測序品種中雙11號存在差異, 主要表現(xiàn)為第1內(nèi)含子上352 bp位置存在單T堿基插入突變, 第4內(nèi)含子1511 bp位置缺失AT堿基, 1582 bp位置缺失14堿基的富A/T序列, 第六內(nèi)含子2228 bp處缺失ATTT, 且第7外顯子3'端相對中雙11號長91 bp。和基因間差異主要在5'端的外顯子與內(nèi)含子上,的5'端相對缺少C03拷貝具有的第2外顯子, 造成其5'-UTR比C03拷貝更短, 二者CDS序列相似度極高, 且與測序品種中雙11號中對應(yīng)拷貝無序列差別。

2.2 BnaPIF4生物信息學(xué)分析

基因各自編碼長度413和414氨基酸殘基的蛋白, 分別命名為BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03, 2個BnaPIF4蛋白的氨基酸組成、摩爾質(zhì)量和等電點如表1。

表1 BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03蛋白信息匯總表

親疏水性分析顯示, BnaPIF4蛋白主要表現(xiàn)疏水性, 在C端約280殘基位置存在一個跨膜結(jié)構(gòu)。Wolf-pSORT與Plant-mPLoc亞細胞定位預(yù)測顯示, BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03均定位于細胞核, 這與PIF4蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的功能一致。

BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖3, BnaPIF4_A03有23%α螺旋, 21%β折疊, 26%β轉(zhuǎn)角, 30%無規(guī)卷曲; BnaPIF4_C03有25%α螺旋, 20%β折疊, 25%β轉(zhuǎn)角和30%無規(guī)卷曲。

通過ANTHEPROT分析了BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03蛋白具有的序列特異性識別位點(表2)。

圖3 BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03蛋白二級結(jié)構(gòu)

表2 BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03蛋白特殊識別位點序列總表

PS00001: 糖基化位點; PS00005: 蛋白激酶C磷酸化位點; PS00006: 酪蛋白激酶2磷酸化位點; PS00007: 酪氨酸激酶磷酸化位點; PS00008: 豆蔻?；稽c; PS00016: 細胞附著序列; PS00845: CAP-Gly信號域。

PS00001: N-glycosylation site; PS00005: protein kinase C phosphorylation site; PS00006: casein kinase II phosphorylation site; PS00007: tyrosine kinase phosphorylation site; PS00008: N-myristoylation site; PS00016: cell attachment sequence; PS00845: CAP-Gly domain signature.

BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03具有僅含微弱差別的特異性識別序列, BnaPIF4_A03相較BnaPIF4_ C03缺少109~111的蛋白激酶C磷酸化位點、278~ 281的酪蛋白磷酸化位點和239~244的?；稽c。整體來看BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03的特異性識別位點基本一致, 主要是多種激酶的磷酸化修飾位點、小分子結(jié)合位點和?；鹊鞍仔揎椢稽c, 多數(shù)與轉(zhuǎn)錄因子功能相關(guān), 這與PIF4蛋白是bHLH家族成員的結(jié)論一致。

使用SMART和MOTIF分析結(jié)構(gòu)域(圖4)發(fā)現(xiàn), 2個BnaPIF4蛋白具有基本相同的結(jié)構(gòu)域且主要集中于C端, 且多為具有核酸結(jié)合功能的結(jié)構(gòu)域, 表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子特性。在第250殘基到第310殘基之間具有多個重疊的bHLH結(jié)構(gòu)域, 親疏水性分析發(fā)現(xiàn)的跨膜結(jié)構(gòu)域在第280殘基左右, 正位于bHLH結(jié)構(gòu)域中段, 這與PIF4作為典型的bHLH家族成員的結(jié)論一致。

圖4 BnaPIF4氨基酸序列比對

通過不同數(shù)據(jù)庫, 共獲得來源于41種不同植物的127條PIF4蛋白序列, 使用MEGA6.0進行聚類分析, 繪制進化樹(圖5)。

PIF4蛋白聚類表現(xiàn)出與植物親緣關(guān)系的高度一致性, 大部分植物中均存在PIF4蛋白的高拷貝現(xiàn)象, 且各拷貝之間的相似性高, 基本上處于同一進化分支。PIF4蛋白大體上按植物科屬分布聚類, 如豆科的花生、綠豆、大豆等多拷貝PIF4蛋白高度聚類(圖5右上), 十字花科的甘藍型油菜、白菜、擬南芥、亞麻芥等多拷貝PIF4蛋白高度聚類, 但禾本科植物中PIF4蛋白分化比較極端, 水稻、狗尾草、玉米等禾本科植物中PIF4蛋白具有較遠的分支距離, 且同一物種中不同的PIF4拷貝也表現(xiàn)出較高的分化水平, 如水稻不同亞種、不同拷貝的PIF4蛋白被聚類到完全隔離的分支上(圖5左上)。另外, PIF4蛋白表現(xiàn)出木本植物分化程度低于草本植物的規(guī)律, 如梨、李、榴蓮、可可等木本植物處于不同的科屬但PIF4蛋白分支距離相對較小, 且與卷柏中PIF4具有較近的分支距離, 而禾本科的水稻、玉米、狗尾草等, 茄科的番茄、馬鈴薯、煙草等草本植物PIF4蛋白均表現(xiàn)相對較高的分化程度。表明PIF4蛋白在進化過程中相對保守, 其分化發(fā)生在進化較晚的階段, 且分化過程劇烈, 表現(xiàn)出低等植物中PIF4高度一致, 高等植物中PIF4分化程度顯著提高, 在進化過程中PIF4蛋白大量發(fā)生重復(fù), 表現(xiàn)為大量植物中存在多個PIF4蛋白拷貝。

圖5 不同植物PIF4蛋白的進化樹分析

: 擬南芥;subspLyrata: 深山南芥;: 花生;: 曼花生;: 二穗短柄草;L.: 甘藍型油菜;L.: 白菜;: 亞麻薺;: 辣椒;: 碎米薺;: 克萊門柚;: 榴蓮;: 油棕;: 鹽芥;: 大豆;: 苜蓿;: 桑;: 林煙草;: 絨毛狀煙草;Group: 水稻(粳);: 中國梅;: 狹葉羽扇豆;: 芝麻;: 番茄;: 小番茄;: 高粱;: 胡楊;: 歐洲大葉楊;: 桃;: 鴨梨;: 卷柏;: 狗尾草;: 醉蝶花;: 可可;: 紅豆;: 綠豆;var.: 赤小豆;: 馬鈴薯;: 釀酒葡萄;: 玉米;: 棗。

2.3 BnaPIF4和BnaBZR/BES互作

使用酵母雙雜檢測了BnaPIF4與BnaBZR1, BnaBES1/2蛋白互作, 酵母單雜交檢測了BnaPIF4與,基因啟動子之間的互作(圖6)。從酵母雜交實驗結(jié)果可見, BnaPIF4_A03與BnaPIF4_C03互作模式一致, 均可以與BnaBZR1, BnaBES1/2蛋白互作, 但不能結(jié)合、基因的啟動子,和也不相互與啟動子結(jié)合, 顯示BnaPIF4主要通過蛋白層面而非轉(zhuǎn)錄層面的互作參與甘藍型油菜的生物學(xué)調(diào)控。BnaPIF4可能通過HLH結(jié)構(gòu)域結(jié)合BnaBZR/BES蛋白, 從而影響后者磷酸化, 調(diào)控磷酸化修飾水平介導(dǎo)后者的核質(zhì)穿梭, 調(diào)控與下游靶基因啟動子的結(jié)合, 共同調(diào)控下游基因表達。

2.4 甘藍型油菜中BnaPIF4時空表達特征

為進一步了解在甘藍型油菜中的功能, 對甘藍型油菜不同時期, 基于5'-UTR差異對不同組織中表達進行分析。

由圖7-A與圖7-B比較可見, 湘油15號中具有相同的表達模式, 基因表達均表現(xiàn)明顯的組織差異和一定的生長發(fā)育時間差異。基因主要表達于油菜的綠色組織, 莖表皮、未成熟角果和葉中表達量較高, 在花和根中表達較低, 葉中表達水平最高, 其次為莖表皮和未成熟的角果, 這些位置是植物感受光信號刺激、發(fā)生光合作用的主要場所, 會聚集大量光敏色素, PIF4作為光信號的負調(diào)控因子, 可能受到光敏色素濃度的影響, 改變表達水平以對光信號做出響應(yīng)。在生育進程中,基因表達量差異不明顯, 整體表現(xiàn)為苗期和薹期表達量稍高, 隨生育進程有緩慢降低的趨勢, 這可能是由于隨油菜生長發(fā)育, 光敏色素積累降低, 造成表達做出調(diào)整, 也可能與油菜激素水平有關(guān)系, 油菜快速生長的苗期和薹期生長素、油菜素內(nèi)酯等激素均保持較高水平, 可能通過激素與光信號互作, 影響表達。表達與光信號之間存在著反饋調(diào)節(jié), 一方面光信號受到的負調(diào)控, 另一方面外源光變化也能誘導(dǎo)表達變化, 這表明在油菜光信號途徑中具有重要作用。

圖6 BnaPIF4和BnaBZR/BES互作

圖7 不同發(fā)育時期的湘油15號根、莖、葉、花和角果中BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03的表達量

DAG表示種子萌發(fā)后天數(shù)。DAG means days after seed germination.

3 討論

從甘藍型油菜湘油15號中克隆獲得2個基因拷貝, 其中拷貝與測序品種中雙11號對應(yīng)拷貝存在內(nèi)含子和3'-UTR序列差異, CDS序列一致。和基因結(jié)構(gòu)基本一致, 基因、全長mRNA和CDS序列相似度均超過90%, 表明基因高度保守。BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03蛋白具有典型的植物bHLH結(jié)構(gòu)域, 預(yù)測亞細胞定位于細胞核, 具有多重轉(zhuǎn)錄因子功能的序列結(jié)合元件, 存在大量磷酸化和?；δ芪稽c, 表明克隆獲得的基因?qū)儆谥参锘蚣易? 這與擬南芥、水稻等植物[16]中結(jié)構(gòu)和功能一致。

對植物PIF4蛋白的聚類分析顯示其在進化上具有較高的保守性, 且蛋白進化關(guān)系與物種進化關(guān)系密切, 近緣物種中的PIF4蛋白高度保守, 但高等植物相對低等植物中PIF4蛋白明顯高分化, 表明PIF4蛋白分化可能是一個較晚但相對劇烈的進化事件, 這與植物bHLH家族進化保守性基本一致[17]。NCBI數(shù)據(jù)庫中共收錄了6條甘藍型油菜及其類似序列, 2個位于A染色體組, 4個位于C染色體組, 這表明家族序列在甘藍型油菜亞基因組間分布可能不平衡, 但6個及類似序列保守性較高, 這顯示了甘藍型油菜A、C亞基因組在進化關(guān)系上具有較高的同源性但存在各自獨立的進化過程, 也間接證實“禹氏三角”中白菜與甘藍的近緣關(guān)系[18]。

植物PIF4蛋白參與植物開花、病原免疫、非生物脅迫抗性等生物學(xué)過程, 是光信號途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。在高溫誘導(dǎo)下擬南芥中PIF4可直接激活FT的表達, 正調(diào)控擬南芥的開花,突變體在持續(xù)高溫條件下表現(xiàn)小株型和晚花表型, 隨著溫度的升高, PIF4負調(diào)控植物免疫反應(yīng)、促進擬南芥的生長發(fā)育[19]。PIFs轉(zhuǎn)錄因子家族是整合光信息與植物激素信號的橋梁[20], 其中PIF4介導(dǎo)光信號和多種植物激素信號的互作[21], PIF4與BZR/BES復(fù)合體結(jié)合介導(dǎo)光信號與油菜素內(nèi)酯信號之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文通過酵母雜交證實甘藍型油菜中BnaPIF4和BnaBZR/BES基于蛋白結(jié)合而非轉(zhuǎn)錄層面的互作介導(dǎo)光信號和油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 但有研究顯示PIF4[22]和BZR1[23]均能對油菜素內(nèi)酯生物合成產(chǎn)生調(diào)控, 表明PIF4對油菜素內(nèi)酯生物合成的反饋通路不同于PIF4通過與BZR/BES結(jié)合介導(dǎo)光信號與油菜素內(nèi)酯信號互作的通路, 對油菜素內(nèi)酯合成的反饋可能有更多生理功能。同時本文在PIF4蛋白進化分析中發(fā)現(xiàn)植物中大量存在PIF4蛋白重復(fù), 也表明PIF4功能冗余或者具有除介導(dǎo)光信號之外的功能, 尚待進一步研究。

湘油15號中和的表達規(guī)律一致, 這與基因的保守性相統(tǒng)一, 2個基因拷貝CDS、mRNA、全長基因和啟動子序列均具有高度相似性, 可能具有共同的上游調(diào)控因子, 對植物內(nèi)、外環(huán)境因素可能具有相同的響應(yīng)模式。和序列差異主要發(fā)生在5'端的內(nèi)含子和5'-UTR上, 二者可能存在轉(zhuǎn)錄和翻譯穩(wěn)定性上的差異。甘藍型油菜中基因的表達調(diào)控規(guī)律、蛋白翻譯穩(wěn)定性、翻譯后修飾過程、基因功能等有待進一步研究。

4 結(jié)論

從甘藍型油菜湘油15號中克隆到2個基因, 分別定位于A03和C03染色體, 分別命名為和, 全長編碼序列(coding sequence, CDS)、全長mRNA和全長基因分別為1242 bp和1245 bp、1701 bp和1731 bp、2527 bp和2665 bp, 各自編碼413和414個氨基酸。2拷貝差異序列集中于5'端UTR和內(nèi)含子, 與測序品種中雙11號中對應(yīng)拷貝存在內(nèi)含子序列差異。BnaPIF4_A03和BnaPIF4_C03具有典型bHLH結(jié)構(gòu)域, 與白菜、擬南芥等十字花科植物PIF4蛋白高度相似, 植物中PIF4高度保守。甘藍型油菜中PIF4與BZR/BES存在蛋白層面的互作關(guān)系。分析了和基因的時空表達。

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Cloning and characterization of phytochrome interacting factor 4 (BnaPIF4) gene fromL.

FENG Tao and GUAN Chun-Yun*

College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan, Changsha 410128, Hunan, China

Phytochrome interacting factor 4 (PIF4) is a key transcription factor in light signaling pathway of plants, PIF4 interacts with Brassinazole-resistant (BZR) to mediate the interaction between light signal and brassinosteroid signal and participates in plant photoresponse. In this study, two novelgene were isolated fromL. cv. Xiangyou 15, they were identified on chromosomes A03 and C03 and encoding 413 and 414 amino acids, respectively, named asand, their coding sequence (CDS), full-length mRNA and full-length gene were 1242 bp and 1245 bp, 1701 bp and 1731 bp, 2527 bp and 2665 bp, respectively.andhad seven and eight exons, six and seven introns, respectively. Compared with the sequenced Zhongshuang 11,gene had a single base insertion mutation in the first intron, a deletion mutation in the fourth and sixth introns, and a longer 3'-UTR. Other sequences of the two genes did not differ between Xiangyou 15 and Zhongshuang 11. Theandgene-encoded proteins had a typical plant bHLH domain and were subcellularly localized in the nucleus. They are typical plant PIF4 proteins. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the BnaPIF4 protein was highly homologous to the PIF4 protein of,, and. The evolutionary relationship of PIF4 protein was consistent with that of species, and the PIF4 proteins in the closely related species are highly clustered in the phylogenetic tree. PIF4 protein repeats were observed in a large number of plants and the degree of differentiation of PIF4 was lower in lower plants than in higher plants. It indicates that PIF4 protein differentiation is a late evolutionary event and there may be functional redundancy in PIF4 protein. Yeast hybridization experiments showed that there were interactions between BnaPIF4 and BnaBZR proteins, but BnaPIF4 could not interact with the promoter ofgene, indicating thatinteracts withat the protein level but not at the transcription level. The genes expression patterns ofandin Xiangyou 15 were consistent.gene was mainly expressed in the green tissue ofL., with higher expression levels in stem epidermis, immature pods and leaves, and lower expression levels in flowers and roots, and the gene expression level ofgradually decreased in the development process ofL.

L; phytochrome interacting factor 4; gene clone; interaction of gene; gene expression; bionformatic analysis

2018-06-21;

2018-08-20;

2018-09-25.

10.3724/SP.J.1006.2019.84085

官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com

E-mail: 812298771@qq.com

本研究由國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2015CB150206)資助。

This study was supported by the National Basic Research Program (973 Program) (2015CB150206).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180920.1555.002.html