壯藥白花九里明干預(yù)心肌損傷和保護(hù)心肌細(xì)胞作用的研究

陳天 王彩冰 陳柏樺 歐庾婷 韋顯林 趙碧旺

【摘?要】?目的：探討白花九里明在心肌缺血損傷的干預(yù)保護(hù)作用及作用機(jī)制。方法：60只小鼠分為：正常對(duì)照組和模型對(duì)照組（給予0.9%氯化鈉注射液灌胃），硝酸甘油組（給予13?mg/mL灌胃），白花九里明提取液低、中、高濃度組（分別給予150、300、600?mg/mL灌胃）;同時(shí)正常對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射液，其余各組給予垂體后葉素注射液0.26?U/mL腹腔注射;連續(xù)用藥?15?d，檢測小鼠心電圖、心肌總蛋白（TP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、過氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及心肌組織形態(tài)。結(jié)果：模型對(duì)照組的P波時(shí)限明顯小于其余各組（P<0.01）、J點(diǎn)上移明顯高于其余各組（P<0.01）。正常對(duì)照組的心率明顯低于其余各組（P<0.01，0.05）。白花九里明中濃度組的TP濃度明顯高于正常對(duì)照組、硝酸甘油組、白花九里明低濃度組，SOD活性明顯低于這些組（P<0.01，0.05）;白花九里明高濃度組的TP濃度明顯高于其余組、SOD活性明顯低于其余組（P<0.01）;白花九里明中濃度組與高濃度組的AST濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而均明顯低于其余各組（P<0.01）。白花九里明高濃度組和正常對(duì)照組的MDA比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而又明顯低于其余組（P<0.01，0.05）;白花九里明中濃度組的MDA明顯低于白花九里明低濃度組（P<0.05）。模型對(duì)照組心肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，心肌細(xì)胞間毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張，細(xì)胞變性壞死區(qū)域明顯;硝酸甘油組、白花九里明低濃度組和中濃度組的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)優(yōu)與模型對(duì)照組，心肌細(xì)胞間毛細(xì)血管擴(kuò)張和變性壞死區(qū)域等均有較大的改善;白花九里明高濃度組的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，沒有明顯變性壞死和毛細(xì)血管擴(kuò)張現(xiàn)象，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)表達(dá)相接近并明顯優(yōu)于白花九里明低濃度組和中濃度組。結(jié)論：白花九里明有改善心肌細(xì)胞缺血缺氧、干預(yù)氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)作用，這些作用存在量效正相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】?白花九里明;垂體后葉素;心肌損傷;干預(yù);保護(hù)

【中圖分類號(hào)】R285.5?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）22-0017-05

Zhuang?Medicine?Blumea?Megacephala?on?Research?by?Intervention?of

Myocardial?Injury?and?Protects?of?Heart?Cells

CHEN?Tian?WANG?Caibing*?CHEN?Bohua?OU?Yuting?WEI?Xianlin?ZHAO?Biwang

Youjiang?Medical?College?For?Nationalities，Baise??533000，China

Abstract：Objective?Explore?the?protective?effect?intervention?and?mechanism?of?Blumea?megacephala?on?myocardial?injury?in?mice.?Methods?Sixty?mice?divided：?Normal?control?group?and?Model?control?group?（give?0.9%?NaCl?injection），?Nitroglycerine?group?（give?13mg/mL?Nitroglycerine），Blumea?megacephala?low，?medium?and?high?concentration?groups?（respectively?give?150，?300，?600mg/ml?Blumea?megacephala?extract）;?Intraperitoneal?injection：?Normal?control?group?give?0.9%?NaCl?injection，?Other?groups?give?0.26U/mL?pituitrin?injection.?Continuous?use?of?15d，?detection?ECG?of?mice，?detection?TP、AST、SOD、MDA?and?tissue?section?in?the?heart.?Results?Model?control?group?the?P?wave?duration?obviously?shorter?than?other?groups?（P<0.01），the?J?point?move?up?obviously?higher?than?other?groups?（P<0.01）.?Normal?control?group?the?heart?rate?obviously?below?than?other?groups?（P<0.01，0.05）.?Blumea?megacephala?medium?concentration?group?the?TP?obviously?higher?than?Normal?control?group，?Nitroglycerine?group，?Blumea?megacephala?low?concentration?group，?and?SOD?activity?obviously?below?than?these?groups?（P<0.01，0.05）.?Blumea?megacephala?high?concentration?group?the?TP?obviously?higher?than?other?groups，?and?SOD?activity?obviously?below?than?other?groups?（P<0.01）.?Blumea?megacephala?medium?concentration?group?and?high?concentration?group?the?AST?are?no?significant?difference，?but?obviously?below?than?other?groups?（P<0.01）.?Blumea?megacephala?high?concentration?group?and?Normal?control?group?the?MDA?are?no?significant?difference，?but?obviously?below?than?other?groups?（P<0.01，0.05）.?Blumea?megacephala?medium?concentration?group?the?MDA?obviously?below?than?low?concentration?group?（P<0.05）.?Model?control?group?myocardial?cell?the?number?is?significantly?reduced，the?capillary?expansion?between?myocardial?cells?is?obvious，?and?the?area?of?cell?degeneration?necrosis?is?obvious.?Nitroglycerine?group，?Blumea?megacephala?low?and?medium?concentration?groups?the?cardiomyocyte?structure?was?better?than?that?of?the?Model?control?group，?the?intercellular?capillary?dilation?and?denaturation?necrosis?of?cardiac?myocytes?were?all?greatly?improved.?Blumea?megacephala?high?concentration?group?yocardial?cell?structure?is?clear，?there?is?no?obvious?degenerative?necrosis?and?capillary?dilation，?it?is?close?to?the?normal?control?group?myocardial?cell?structure?expression，?and?obviously?excellent?than?Blumea?megacephala?low?and?high?concentration?groups.Conclusions?Blumea?megacephala?have?improve?myocardial?ischemia?and?hypoxia，?intervention?oxygen?free?radicals?on?myocardial?cell?injury，?promotion?of?cardiomyocyte?repair;?These?effects?have?positively?correlated?in?the?dosage?and?effectof.

Keywords：Blumea?megacephala;?Pituitrin;?Myocardial?Injury;?Intervention;?Protects

白花九里明[Blumea?megacephala?（Randeria）]屬菊科植物，為廣西壯族民間常用藥，外敷用于治療跌打腫痛，內(nèi)服用于治療風(fēng)濕骨痛、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后流血[1-2]。近年研究文獻(xiàn)報(bào)道，白花九里明具有鎮(zhèn)痛消炎、護(hù)肝止血、降壓升糖等作用[3-7]。而白花九里明對(duì)心肌缺血缺氧損傷方面影響未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用垂體后葉素制備小鼠急性心肌缺血缺氧損傷模型，以白花九里明民間用量[1-2]換算成小鼠用量[8]給小鼠灌胃，研究白花九里明對(duì)心肌損傷的干預(yù)保護(hù)作用及作用機(jī)制，并與臨床抗心絞痛藥物硝酸甘油[9]的保心作用相比較，為白花九里明的利用與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?健康SPF級(jí)KM小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)重25～35?g，由廣西右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2017-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2017-0003）。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18～22?℃、濕度?50?%～60?%、日光照?12?h。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2?藥材、藥品、試劑和儀器?白花九里明采于廣西百色市郊（經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族教研室覃道光教授鑒定為白花九里明植物），曬干備用。硝酸甘油（北京益民藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150314）;垂體后葉素注射液（安微宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110311）;0.9%氯化鈉注射液（廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：L16062904）;氨基甲酸乙酯（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20161101）;甲醛（煙臺(tái)市雙雙化工有限公司，批號(hào)：20170701）;TP定量測試盒、AST測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒?（南京建成生物工程研究所，規(guī)格：96T，批號(hào)分別為20171130、20171202、20171204、20171201）。多功能酶標(biāo)儀（上海壹僑國際貿(mào)易有限公司，型號(hào)TriStar?LB941）;心電圖機(jī)（廣州市艾迪科遜醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：ECG-6511），數(shù)碼顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BA2100igital）;離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào);TGL-16G）;手持臺(tái)式兩用均質(zhì)器（PRO?Scientific?Inc?Oxford?CT?USA，型號(hào)：PR0200）;三用恒溫水箱（江蘇金壇宏凱儀器廠，型號(hào)：HH-W600）。

1.3?白花九里明提取液的制備?將60g白花九里明干草加入30℃左右的溫水2000mL浸泡1h，文火煮沸1h，16層紗布過濾，保留濾液;濾渣再加入30℃左右的溫水2000mL文火煮沸1h，16層紗布過濾，兩次濾液合起用文火隔水濃縮至100mL（相當(dāng)于生藥600mg/mL），冷卻后放入4℃冰箱保存，用時(shí)以雙蒸水配制成低濃度和中濃度（150mg/mL、300mg/mL）的白花九里提取液。每5天提取1次。

1.4?動(dòng)物分組與給藥方法?取60只健康SPF級(jí)KM小鼠隨機(jī)均分為6組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組（給予0.9%氯化鈉注射液灌胃），硝酸甘油組（給予13mg/mL灌胃），白花九里明提取液低、中、高濃度組（分別給予150、300、600mg/mL灌胃）;正常對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，其余各組給予垂體后葉素注射液0.26U/mL腹腔注射;灌胃和腹腔注射的量均按小鼠?10mL/kg體質(zhì)重計(jì)算，每天1次，連續(xù)15d。

1.5?心電圖檢測?小鼠于末次用藥前禁食12h、禁水2h，末次用藥后用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，通過心電圖機(jī)描記藥后10min的心電圖肢體Ⅱ?qū)?lián)波型。由同一人檢測心電圖各波段的情況。

1.6?小鼠心肌勻漿制備及心肌組織病檢?于心電圖檢測后迅速將小鼠剖胸取心臟，取右心組織放入冰凍0.9%NaCl溶液試管中用勻漿機(jī)勻漿，制成10%的心肌勻漿離心分離出上清液;取左心浸泡于10%甲醛溶液固定?30?min，再脫水、石臘包埋、HE染色制備組織切片，用數(shù)碼顯微鏡檢查心肌組織結(jié)構(gòu)并攝像。

1.7?小鼠心肌總蛋白（TP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的測定?取小鼠心肌勻漿上清液，分別用TP定量測試盒、AST測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒按說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測出心肌中TP、AST、SOD、MDA的濃度。

1.8?數(shù)據(jù)處理?應(yīng)用SPSS?16.0統(tǒng)計(jì)軟件將數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較通過q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)果

2.1?各組小鼠心電圖檢測結(jié)果比較?P波時(shí)限：白花九里明中濃度組和高濃度組明顯大于正常對(duì)照組（P<0.01，0.05），模型對(duì)照組明顯小于其余各組（P<0.01），硝酸甘油組、白花九里明低濃度組和正常對(duì)照組的兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。QRS波時(shí)限和P-R段時(shí)限各組間兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。模型對(duì)照組的J點(diǎn)上移明顯高于其余各組（P<0.01），其余各組J點(diǎn)上移的兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。正常對(duì)照組的心率明顯低于其余各組（P<0.01，0.05），而其余各組間的心率兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1。