SDF-1/CXCR4軸調(diào)控BMSCs定向分化修復(fù)大鼠急性脊髓損傷的研究

何 寧，曾 云，王志勇，韓 珩，唐 冰，熊 敏

0 引言

急性脊髓損傷是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到嚴(yán)重創(chuàng)傷，主要臨床表現(xiàn)為大小便完全失禁、運(yùn)動功能完全喪失、患者的知覺喪失等。其發(fā)病機(jī)制主要是因?yàn)榧顾璩霈F(xiàn)急性損傷使患者喪失大量的脊髓神經(jīng)元，進(jìn)而導(dǎo)致失去對脊髓的修復(fù)能力。并且神經(jīng)元大量壞死也會產(chǎn)生空洞與膠質(zhì)瘢痕，這些都會對軸突生長造成一定阻礙。因此，急性脊髓損傷在臨床治療中是非常棘手的問題[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是臨床中最早發(fā)現(xiàn)的、在臨床中比較常用的間充質(zhì)干細(xì)胞，其不僅具有強(qiáng)大的增殖能力，而且具有多向分化潛能，BMSCs已成為軟骨組織工程中重要的種子細(xì)胞[2]。在此次研究中，筆者對急性脊髓損傷模型大鼠移植SDF-1/CXCR4軸調(diào)控后定向分化的BMSCs進(jìn)行研究，觀察急性脊髓損傷模型大鼠的修復(fù)情況，以評價SDF-1(Stromal cell-derived factor-1,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1)/CXCR4(CXC chemo-kine receptor 4,CXC趨化因子受體4)軸對BMSCs的調(diào)控效果及定向分化后的BMSCs對急性脊髓損傷模型大鼠的治療效果，分析其臨床應(yīng)用的合理性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性SD大鼠60只，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，大鼠體重(221.34±21.41) g。

1.1.2 所需試劑 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞液體培養(yǎng)基(購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；CXCR4阻斷劑AMD3100(購自美國Ab Mole公司)；RNA提取試劑盒(購自北京博凌科為生物技術(shù)有限公司)；RT-PCR試劑盒(購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司)；SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒(購自上海生工生物有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自德國Thermo scientific公司)；胎牛血清(購自浙江碧云天生物技術(shù)有限公司)；Ficoll液(購自大連Takara生物有限公司)；Rabbit Anti-SDF-1 antibody、Rabbit Anti- CXCR4 antibody、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均購自Abcam公司；其他試劑為分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 Thermo ScientificTM8000細(xì)胞培養(yǎng)箱(購自德國Thermo有限公司)；BHC-1360ⅡA/B3型生物安全柜(購自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；LegendTMXT/XF臺式高速冷凍離心機(jī)(購自德國Thermo有限公司)；ECLIPSE Ti型倒置顯微鏡(購自日本尼康公司)；DZY-E5電轉(zhuǎn)儀與DYY-6C型高壓電泳儀(購自北京六一儀器廠)；凝膠成像分析儀(購自蘇凈安泰公司)；Nicolet多功能電生理儀(購自美國Nicolet公司)；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀(購自美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組情況 隨機(jī)將60只SD大鼠分為3組，分別為移植組、正常對照組和調(diào)控移植組，每組20只。所有大鼠構(gòu)建急性脊髓損傷模型，移植組大鼠進(jìn)行BMSCs移植，調(diào)控移植組大鼠移植SDF-1/CXCR4軸調(diào)控后的BMSCs。

1.2.2 大鼠急性脊髓損傷模型建立 借鑒文獻(xiàn)[3]的研究方法，本文構(gòu)建了大鼠的急性脊髓損傷模型，同時，大鼠損傷術(shù)后1 d運(yùn)動功能評分為0分，表明模型構(gòu)建成功，在構(gòu)建急性脊髓損傷大鼠模型后第9天，對移植組和調(diào)控移植組大鼠運(yùn)動功能評分<9的大鼠進(jìn)行移植。

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備、培養(yǎng)及鑒定 將BALB/c小鼠以頸椎脫臼法處死，在生物安全柜中取小鼠雙側(cè)股骨，使用剪刀將股骨骨髓腔剪開，使用培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，使用移液器緩慢吹打混勻?yàn)榧?xì)胞懸液，加入至Ficoll液上層，密度梯度離心后收集單個核細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的BMSCs液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞至80%～90%豐度(3～5 d)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。使用BD流式細(xì)胞儀對BMSCs進(jìn)行鑒定，對BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD34、CD45、CD90進(jìn)行鑒定。

1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SDF-1/CXCR4軸調(diào)控 在傳代至第5代時，向一組BMSCs中加入CXCR4阻斷劑AMD3100作用48 h，然后將原培養(yǎng)基棄去，加入PBS溶液沖洗3次，加入新的含有10%胎牛血清的BMSCs液體培養(yǎng)基。

1.2.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化后移植 移植前確定各組大鼠運(yùn)動功能評分，移植組和調(diào)控移植組運(yùn)動功能評分<9的大鼠分別為13、15只。將兩組符合要求的大鼠固定在腦脊髓立體定位儀上，暴露損傷區(qū)域，對照組大鼠同樣選擇與損傷模型同樣區(qū)域，將5×105個BMSCs加入至5 μl的氯化鈉溶液(0.9%)中，利用微注射系統(tǒng)把細(xì)胞懸液注射到大鼠脊髓損傷中心部位的空洞中，注射深度為1 mm，注射速度為1 μl/min，對照組大鼠注射5 μl的 0.9%氯化鈉溶液。三組大鼠在移植前及移植后，每天均按照10 mg/kg劑量皮下注射環(huán)孢素A進(jìn)行免疫抑制治療。

1.2.6 運(yùn)動功能評分 對各組大鼠建模前及移植BMSCs后6周、12周分別進(jìn)行運(yùn)動功能評分，評分總分為21分，主要觀察各組大鼠后肢的運(yùn)動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性，爪的置放，足趾間隙及尾的位置，以顯示脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況。三組所有大鼠均由同一實(shí)驗(yàn)人員觀察、記錄。

1.2.7 運(yùn)動誘發(fā)電位的檢測 采用Nicolet 多功能電生理儀在各組大鼠建模前及移植BMSCs后6周、12周，分別對運(yùn)動誘發(fā)電位進(jìn)行檢測，無菌環(huán)境中切開大鼠的背部皮膚，將刺激電極插入到T5-6椎間隙。將參考電極插入到棘旁肌，在后肢腓腸肌插入兩根記錄電極，以強(qiáng)度5 mA、頻率1 Hz的單方波脈沖刺激大鼠椎間隙。最終評價指標(biāo)為損失上下方的波幅差值與潛伏期差值，損失上下方的運(yùn)動誘發(fā)電位差值越小，說明具有更好的傳導(dǎo)功能[4]。

1.2.8 RT-PCR檢測SDF-1及CXCR4 mRNA的表達(dá) 在生物安全柜中將大鼠海馬組織剝離，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后選GAPDH為內(nèi)參，利用RT-PCR檢測BMSCs中SDF-1及CXCR4的表達(dá)情況。

1.2.9 Western blot檢測SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá) 加入裂解液后，提取大鼠海馬組織總蛋白，采用Western blot 檢測SDF-1及CXCR4的蛋白表達(dá)情況，首先進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，切下有目的條帶的凝膠后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后加入一抗作用8 h，沖洗后加入二抗作用2 h。沖洗后使用顯色試劑盒進(jìn)行顯色。采用Bandscan軟件對獲得的圖片進(jìn)行灰度值分析，以評價SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定情況 采用BD流式細(xì)胞儀對獲得的BMSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，CD34、CD45為陰性，而CD29、CD90的陽性率>95%，見圖1。

圖1 BMSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定情況

2.2 SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)情況 采用RT-PCR對三組移植前及移植后6周、12周大鼠海馬組織中SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，三組大鼠移植前SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在移植SDF-1/CXCR4軸調(diào)控的BMSCs后，調(diào)控移植組大鼠SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)量明顯下降，而移植組大鼠在移植BMSCs后，SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)量無明顯下降，其中調(diào)控移植組大鼠在移植SDF-1/CXCR4軸調(diào)控的BMSCs移植6周、12周后，SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)量與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 SDF-1、CXCR4 mRNA的表達(dá)情況

2.3 SDF-1、CXCR4蛋白的表達(dá)情況 采用Western blot對三組移植前、移植后6周、12周大鼠海馬組織中SDF-1、CXCR4蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，三組大鼠移植前SDF-1、CXCR4 蛋白的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，調(diào)控移植組大鼠在移植SDF-1/CXCR4軸調(diào)控的BMSCs后，SDF-1、CXCR4 蛋白的表達(dá)量明顯下降，而移植組大鼠在移植BMSCs后，SDF-1、CXCR4 蛋白的表達(dá)量未明顯下降，其中調(diào)控移植組大鼠在移植SDF-1/CXCR4軸調(diào)控的BMSCs后6周、12周，SDF-1、CXCR4蛋白的表達(dá)量與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 SDF-1、CXCR4蛋白的表達(dá)情況

2.4 運(yùn)動功能評分情況 移植前，調(diào)控移植組、移植組大鼠運(yùn)動功能評分與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。移植后，調(diào)控移植組、移植組大鼠運(yùn)動功能評分明顯升高(P<0.05)，但仍低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，調(diào)控移植組大鼠運(yùn)動功能評分高于移植組(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠運(yùn)動功能評分情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與移植前比較，#P<0.05；與移植組比較，△P<0.05

2.5 運(yùn)動誘發(fā)電位情況 移植前，調(diào)控移植組、移植組大鼠誘發(fā)電位潛伏期差值與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。移植后，調(diào)控移植組、移植組大鼠誘發(fā)電位潛伏期差值升高(P<0.05)，且高于對照組(P<0.05)，調(diào)控移植組大鼠誘發(fā)電位潛伏期差值高于移植組(P<0.05)。見表2。

對三組大鼠移植前、移植后誘發(fā)電位波幅差值情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，移植前，調(diào)控移植組、移植組大鼠誘發(fā)電位波幅差值與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。移植后，調(diào)控移植組大鼠移植后誘發(fā)電位波幅差值升高(P<0.05)，且調(diào)控移植組大鼠誘發(fā)電位波幅差值高于對照組、移植組(P<0.05)，見表3。

表2 三組大鼠誘發(fā)電位潛伏期差值情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與移植前比較，#P<0.05；與移植組比較，△P<0.05

表3 三組大鼠誘發(fā)電位波幅差值情況

注：與對照組比較，*P<0.05；與移植前比較，#P<0.05；與移植組比較，△P<0.05

3 討論

急性脊髓損傷的致殘率與死亡率很高，對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了很大的影響[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，引起急性脊髓損傷肢體功能性障礙的主要原因之一是繼發(fā)性損傷，其機(jī)制主要包括血栓的形成、血管痙攣、水腫、微循環(huán)障礙、自由基的形成以及興奮性氨基酸生成等[6-8]。

目前，很多研究者認(rèn)為，MSCs移植能否修復(fù)腦損傷與SDF-1及CXCR4軸存在密切關(guān)系[9]。CXCR4、SDF-1在細(xì)胞核多種組織中均存在，人體內(nèi)SDF-1、CXCR4摘除會導(dǎo)致胃腸道、小鼠小腦及造血系統(tǒng)發(fā)育出現(xiàn)異常而引起胚胎在早期死亡[10]。在MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞時，阻斷CXCR4、SDF-1信號能夠抑制骨形成蛋白2的誘導(dǎo)[11]。因此，在干細(xì)胞的遷移過程中，CXCR4、SDF-1具有重要作用，其在干細(xì)胞分化、組織器官再生方面都起到了明顯作用。

人體的神經(jīng)細(xì)胞死亡需要正常的神經(jīng)元進(jìn)行替代，運(yùn)動神經(jīng)元、中間神經(jīng)元及其他脊髓神經(jīng)元都是如此[12]。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)死亡就無法進(jìn)行再生，患者在治療過程中主要以化療、抗炎及保護(hù)細(xì)胞為主，主要是最大可能地保護(hù)殘存的細(xì)胞組織，阻止細(xì)胞損傷的擴(kuò)大，阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展。而干細(xì)胞或前體細(xì)胞的治療則可以重建中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[13]。

間充質(zhì)干細(xì)胞在適宜環(huán)境中能夠分化成神經(jīng)外胚層與中胚層細(xì)胞，即間充質(zhì)干細(xì)胞具有可再生性。研究者將MSCs注射到新出生小鼠的側(cè)腦室，研究結(jié)果顯示，整個小腦與前腦都出現(xiàn)MSCs 遷移，海馬與紋狀體中，MSCs呈現(xiàn)為GFAP，已分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞；而在嗅球、嗅覺小島、小腦內(nèi)顆粒層存在大量MSCs，不僅表達(dá)為巢蛋白(Nestein)，還會表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記NSE、特異性核蛋白及神經(jīng)元中絲蛋白，分化成神經(jīng)細(xì)胞[14]。相關(guān)研究表明，通過移植rMSCs，能夠?qū)Υ笫笕毖跞毖阅X損傷的恢復(fù)起到促進(jìn)作用。因此，對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可以利用MSCs替代原來受損或功能缺陷的神經(jīng)組織進(jìn)行治療[15]。

研究結(jié)果顯示，SDF-1/CXCR4軸在組織器官再生、干細(xì)胞分化中的作用不可低估，在 MSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞時，SDF-1借助細(xì)胞內(nèi)MAPK與Smad信號通路對 BMP2 表達(dá)起到促進(jìn)作用，同時誘導(dǎo)MSCs分化為成骨細(xì)胞。并且，SDF-1在人體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中具有不可替代的作用，在神經(jīng)元生長、增殖等方面，CXCR4與SDF-1信號通路發(fā)揮明顯作用，在神經(jīng)元分化、MSCs增殖及軸突過程中發(fā)揮明顯作用。然而，從當(dāng)前研究成果來看，在MSCs分化與增殖過程中，SDF-1/CXCR4 軸的作用機(jī)制還不能完全確定[16]。

本研究表明，采用CXCR4阻斷劑對BMSCs進(jìn)行SDF-1/CXCR4 軸調(diào)控后可以促進(jìn)BMSCs定向分化，在移植至急性脊髓損傷模型大鼠后，可以明顯提高急性脊髓損傷模型大鼠運(yùn)動功能評分及運(yùn)動誘發(fā)電位情況，調(diào)控SDF-1/CXCR4軸后的BMSCs對急性脊髓損傷模型大鼠具有更好的修復(fù)效果，而SDF-1/CXCR4軸調(diào)控對BMSCs定向分化發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。