B7-1、B7-2單抗對狼瘡腎炎小鼠模型的免疫干預(yù)及機制研究

韓蓮花，沈立軍，朱 瑩，邱玉華

0 引言

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)屬于臨床上育齡女性發(fā)病率高于男性的自身免疫性疾病。SLE患者的免疫系統(tǒng)處于高度活躍狀態(tài)，尤其是B淋巴細(xì)胞功能異常，體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體，自身抗原抗體結(jié)合而成的免疫復(fù)合物在機體的器官和組織沉積。這些免疫復(fù)合物的沉積可能造成各個臟器和組織發(fā)生不可逆的功能破壞和喪失，包括血管、皮膚、關(guān)節(jié)、心肺、腎臟等。SLE的具體發(fā)病機制尚未明確，與環(huán)境、內(nèi)分泌等多方面因素有關(guān)。SLE的治療主要以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主。但長期使用這些藥存在多種不良反應(yīng)，給患者帶來了各種嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此，如何尋找有效、不良反應(yīng)少的新的治療方法一直是SLE的研究熱點[1]。

B7分子是表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞(APC)，包括B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的協(xié)同刺激分子，主要包括B7-1(CD80)及B7-2(CD86)。B7-1和B7-2分子都是跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，兩者氨基酸序列有25%的同源性[2]。B7分子主要是和表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD28/CTLA-4結(jié)合產(chǎn)生相應(yīng)的作用，與CD28結(jié)合刺激T淋巴細(xì)胞活化，促進(jìn)特異性T細(xì)胞的增殖、特異性細(xì)胞因子的分泌；而與CTLA-4結(jié)合則轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號，終止T細(xì)胞活化[3]。機體在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中，如果缺乏B7/CD28共刺激信號，T 細(xì)胞可能進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)、免疫耐受，甚至是發(fā)生細(xì)胞凋亡。多項研究表明，B7/CD28 共刺激信號通路的過度活化與多種自身免疫性相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如SLE 患者的細(xì)胞表面存在過度表達(dá)的B7-1和B7-2分子[4-5]。

1 材料與方法

1.1 主要材料 B7-1鼠源性單克隆抗體4E5、B7-2鼠源性單克隆抗體1D1均由本實驗室研制。6～8周齡體重25～30 g的雌性BALB/c小鼠20只，雄性C57BL/J6小鼠10只(上海斯萊克實驗動物中心)。ANA(抗核抗體)，anti-dsDNA(抗雙鏈DNA抗體)檢測試劑盒(北京和杰創(chuàng)新生物有限公司)；FITC羊抗小鼠IgG(cell signaling公司)；尿蛋白(Albustix)檢測試紙(美國Bayer公司)。熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，低速離心機(Eppendorf公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 cGVHD狼瘡樣小鼠模型的建立 雄性C57BL/J6×雌性BALB/c雜交F1代小鼠，取60只雌性F1代小鼠分成4組：正常對照組，模型組，B7-1干預(yù)組，B7-2干預(yù)組。模型建立方法參考本實驗室相關(guān)試驗[6]。B7-1干預(yù)組、B7-2干預(yù)組在淋巴細(xì)胞注射后的第1、3、5、8、15、30、60天，分別通過尾靜脈注射B7-1單抗、B7-2單抗，每只小鼠注射抗體量為8 mg/kg，模型組在相同時間注射等劑量的小鼠Ig同型對照。

1.2.2 血清dsDNA、ANA的檢測 各組實驗小鼠每周眼眶采血1次，收集血清用于檢測dsDNA、ANA。血清用PBS 1∶100稀釋，dsDNA采用間接免疫熒光法檢測：每個血清標(biāo)本20 μl與抗原片室溫避光孵育30 min，洗滌后加入抗dsDNA的熒光二抗20 μl，室溫孵育30 min后，再次洗滌，封片后熒光顯微鏡下觀察?？筪sDNA 抗體陽性時表現(xiàn)為均質(zhì)或環(huán)狀熒光，熒光為一大一小成對出現(xiàn)，陰性時四膜蟲蟲體內(nèi)無熒光。ANA的檢測通過HEp-2細(xì)胞片完成，將待測血清，陽性對照和陰性對照20 μl加到抗原片上，濕盒室溫孵育30 min。然后浸泡至洗片缸內(nèi)清洗，清洗后每孔滴加20 μl FITC-羊抗鼠抗體，濕盒室溫孵育30 min。再浸泡清洗，最后滴加封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 實驗小鼠尿蛋白的檢測 各組實驗小鼠每隔2周的清晨刺激留尿，將小鼠的新鮮尿液滴加到尿蛋白檢測試紙的反應(yīng)顯色區(qū)。放置1 min后，顯色區(qū)顏色發(fā)生改變，根據(jù)顯色區(qū)顏色深淺和標(biāo)準(zhǔn)色帶對比來判斷蛋白尿的嚴(yán)重程度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色帶將蛋白尿分為陰性(-)和5個陽性(±、+、++、+++、++++)級別。

1.2.4 實驗小鼠腎臟組織HE染色 各組實驗小鼠觀察至12周全部處死，取出兩側(cè)腎臟，將其中一側(cè)放于福爾馬林中固定，切片，貼片，脫蠟，水化，HE染色，染色后再脫水，透明，最后用中性樹膠封片，封片完置于病理顯微鏡下，觀察腎臟組織腎小球形態(tài)的改變。

1.2.5 實驗小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變 將實驗小鼠的腎臟取出后，迅速切成立體小塊(約1 mm×1 mm×1 mm)，然后立即投入2.5%戊二醛固定液固定1 h，固定完用PBS漂洗3次，再放入1%鋨酸固定液中固定1 h。浸泡入梯度丙酮進(jìn)行脫水，每次10 min。將組織塊包埋在多孔橡膠模板中，放入烤箱烘干至形成包埋塊。對包埋好的組織進(jìn)行切片，切好的組織片在醋酸鈾溶液中染色2 h，封好的切片置于透射電鏡下觀察。

1.2.6 實驗小鼠腎臟免疫復(fù)合物沉積情況 將腎臟組織放入4%多聚甲醛固定6 h，20%蔗糖組織沉底，OTC包埋冰凍組織塊，切片，貼片，純丙酮處理后風(fēng)干。PBS洗滌3次后BSA室溫封閉1 h，滴加FITC直標(biāo)羊抗小鼠IgG避光4 ℃孵育過夜，第2天用PBS洗滌2次，樣本上滴加防淬滅劑后封片，最后置樣本于熒光顯微鏡下，觀察沉積在腎臟組織的免疫復(fù)合物情況。

2 結(jié)果

2.1 血清dsDNA、ANA的表達(dá)變化 模型組小鼠第2周就能檢測到dsDNA的表達(dá)，第4周能檢測到ANA的表達(dá)。B7-1干預(yù)組第4周能檢測到dsDNA的表達(dá)，第6周能檢測到ANA的表達(dá)。B7-2干預(yù)組第6周能檢測到dsDNA的表達(dá)，第8周能檢測到ANA的表達(dá)?？贵w滴度都低于模型組。見圖1、圖2。

2.2 尿蛋白的變化情況 在第8周，模型組有小鼠檢測到陽性蛋白尿的發(fā)生，數(shù)量為50%，到第12周，所有模型組小鼠都檢測到了蛋白尿(++～++++)。第12周，B7-1干預(yù)組和B7-2干預(yù)組小鼠也都檢測到陽性蛋白尿，B7-1干預(yù)組有50%的小鼠檢測到蛋白尿，尿蛋白含量+～++。B7-2干預(yù)組有40%的小鼠檢測劑蛋白尿，尿蛋白含量+～++。見表1。

表1 12周各組小鼠尿蛋白程度

注：*與模型組比較，P<0.05

2.3 腎臟病理結(jié)構(gòu)改變 模型組的腎臟組織切片可見組織結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的改變，基本結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，腎小球內(nèi)可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，腎小球的體積大于對照組，內(nèi)皮細(xì)胞和系膜基質(zhì)都發(fā)生不同程度的增生，從而導(dǎo)致腎小球囊腔發(fā)生狹窄甚至閉塞。B7-1干預(yù)組腎小球內(nèi)有少許炎性細(xì)胞，腎小球體積輕微增大，毛細(xì)血管腔和腎小球囊腔未變窄。B7-2干預(yù)組腎小球內(nèi)也有少許炎性細(xì)胞，腎小球體積輕微增大，毛細(xì)血管腔和腎小球囊腔結(jié)構(gòu)未發(fā)生變窄情況，兩組干預(yù)組的腎臟結(jié)構(gòu)基本未發(fā)生破壞，病理改變較小。見圖3。

2.4 腎臟超微結(jié)構(gòu)改變 電子顯微鏡下可見，對照組腎小球超微結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)明顯，基底膜厚度均勻。模型組上皮細(xì)胞足突消失，在臟層上皮和基底膜之間存在大量的駝峰狀電子致密物，基底膜發(fā)生節(jié)段性增厚。B7-1干預(yù)組的臟層上皮和基底膜之間也發(fā)現(xiàn)少量電子致密物，基底膜厚度均勻，未見明顯增厚部位。B7-2干預(yù)組臟層上皮和基底膜之間可見少量電子致密物，基底膜也未見明顯增厚部位。見圖4。

2.5 腎臟免疫復(fù)合物沉積 模型組小鼠的樣本上可見多處顆粒狀或線性的熒光，熒光能大致顯示腎小球輪廓，主要聚集在腎小球毛細(xì)血管襻位置，提示有免疫復(fù)合物在腎小球部位沉積。B7-1干預(yù)組樣本上也可見少量顆粒狀熒光，但熒光的分布和強度都較模型組減弱。B7-2干預(yù)組也可見少量顆粒狀熒光，熒光的分布和強度也明顯弱于模型組。見圖5。

圖1 各組小鼠12周時血清dsDNA的表達(dá)(400×)

圖2 各組小鼠12周時血清ANA的表達(dá)(400×)

圖3 各組小鼠腎臟組織HE染色(400×)

圖4 各組小鼠腎臟組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)改變

圖5 各組小鼠腎臟免疫復(fù)合物沉積(400×)

3 討論

機體在發(fā)生正常的免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞需要經(jīng)過活化、增殖、分化才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮需要兩個必要信號的參與：抗原肽-MHC復(fù)合體與T細(xì)胞受體結(jié)合的特異性信號和APC表面協(xié)同刺激分子與其受體結(jié)合的非特異性信號[7]。

B7分子是目前T細(xì)胞活化眾多協(xié)同刺激分子中最重要的分子之一，主要與T細(xì)胞表面的CD28、CTLA-4結(jié)合，從而影響免疫應(yīng)答過程細(xì)胞的分化[8-9]。B7和T細(xì)胞表面受體結(jié)合主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化(分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-10等)，以及CD8+T細(xì)胞向CTL分化；B7-2則主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化以及分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2等[10]。

SLE患者細(xì)胞表面B7-1 和 B7-2分子均過度表達(dá)，不管是在靜息還是活化的B細(xì)胞表面，SLE患者B7-2分子的表達(dá)都比正常人明顯增多，而B7-1在靜息B細(xì)胞上的表達(dá)和正常人沒有顯著差異，只在活化的B細(xì)胞上表達(dá)比正常人明顯增多。Takasaki等[11]報道，B7-1和B7-2分子的過度表達(dá)不僅僅發(fā)生在B細(xì)胞表面，在CD3+T細(xì)胞表面的表達(dá)也增加。在SLE患者皮膚的皮損區(qū)、表皮和真皮上的APC細(xì)胞上也過度表達(dá)了B7-1和B7-2 分子。然而，應(yīng)用激素治療后，皮損區(qū)APC細(xì)胞上的B7-1和B7-2分子的mRNA和蛋白的表達(dá)都減弱甚至消失[12]。

B7-CD28信號通路參與了SLE的發(fā)生發(fā)展，并發(fā)揮重要作用。通過B7-1和B7-2的單抗來調(diào)控B7-CD28信號通路，改變T細(xì)胞的反應(yīng)性，可以減輕SLE模型的過度免疫活化狀態(tài)，減少自身抗體的產(chǎn)生，甚至可能消除SLE模型所發(fā)生的組織學(xué)變化[13-14]。Finck等[15]通過給NZB/NZW F1(B/W) SLE模型鼠注射了B7-1和B7-2的拮抗劑CTLA-4Ig，從而阻斷了模型鼠自身抗體anti-dsDNA的產(chǎn)生，減輕了腎小球和腎間質(zhì)病變，改善了腎炎癥狀。在 B7-1 和 B7-2 雙敲除的 MLR-Fas/lpr模型小鼠中，小鼠的多種細(xì)胞因子如IFN-γ 及 IL-12 表達(dá)量均下降，自身抗體滴度也明顯減少，SLE的各種癥狀得到緩解，蛋白尿消失，腎臟的病理損害減輕[16]。

本次研究對模型組小鼠分別使用B7-1、B7-2單克隆抗體進(jìn)行干預(yù)治療，在自身抗體、腎臟病理改變、蛋白尿的產(chǎn)生、腎小球免疫復(fù)合物沉積方面與模型組小鼠比較，都得到了一定程度的改善。同時，B7-1干預(yù)組、B7-2干預(yù)組治療的結(jié)果并不完全相同。在自身抗體方面，B7-2抗體治療組對自身抗體的抑制作用優(yōu)于B7-1干預(yù)組?？赡苁且驗锽7-2主要參與Th2介導(dǎo)免疫抗體的產(chǎn)生，而SLE疾病正是由于出現(xiàn)了T細(xì)胞的異常分化，出現(xiàn)了過多的Th2細(xì)胞，從而輔助了抗體生成細(xì)胞的激活和增殖，使自身抗體異常分泌，自身抗體和自身抗原結(jié)合物造成了很多關(guān)節(jié)和組織的破壞[17-18]。

SLE患者的抗原提呈細(xì)胞表面高度表達(dá)B7-2，可能是患者的抗體生成細(xì)胞發(fā)生了過度激活和增殖，從而產(chǎn)生自身抗體的始動因素之一。因此，B7-2干預(yù)組對抗體生成細(xì)胞起到了特異性的抑制作用，因此延緩和減少了自身抗體的產(chǎn)生。自身抗體和抗原形成的免疫復(fù)合物會在全身各個部位沉積，腎臟是受損害最嚴(yán)重的器官，狼瘡性腎炎是SLE患者最常發(fā)生和最嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至是很多患者死亡的主要原因。B7-2治療組通過減少自身抗體的產(chǎn)生減輕了腎臟病理損傷，延緩了小鼠狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展。

B7-1干預(yù)和B7-2干預(yù)都降低了機體的早期免疫應(yīng)答，減輕了腎臟的病理損傷。B7-2干預(yù)能更特異性地減少自身抗體的產(chǎn)生，因此對模型小鼠腎炎的發(fā)生發(fā)展有更好的延緩作用。阻斷B7-CD28通路在一定程度上抑制了狼瘡樣腎炎小鼠的異常細(xì)胞免疫應(yīng)答，可在一定程度上防治和改善疾病病情。關(guān)于SLE和其他自身免疫性疾病的研究還在進(jìn)行中，通過減弱或阻斷協(xié)同刺激分子介導(dǎo)機體免疫應(yīng)答所必需的非特異性信號通路的治療方法有望為SLE等自身免疫性疾病提供高效低毒的生物療法。