乏氧環(huán)境下益氣養(yǎng)精方對(duì)肺癌細(xì)胞apelin分子表達(dá)的影響＊

盧文峰，楊茜雯，董 昀，崔 清，蔡霄月，汪宇涵，張 銘＊＊，鄧海濱，徐振曄

（1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 上海200030；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科 上海200032）

肺癌目前是全球癌癥得病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是肺癌患者救治失敗的主要原因。新生血管能為腫瘤的生長(zhǎng)繁殖提供豐富的生長(zhǎng)條件[2]，血管生成是腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]，是腫瘤生長(zhǎng)、原位侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的必要過(guò)程[4]。因此，近些年在血管生成方面的研究是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重點(diǎn)方向。目前多通過(guò)血管生成相關(guān)因子的定量分析來(lái)評(píng)估腫瘤血管生成[5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）等均與腫瘤血管生成有直接或間接的聯(lián)系[6,7]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，apelin/APJ系統(tǒng)在細(xì)胞遷移、增殖以及血管形成上發(fā)揮了重要的作用，能加速體內(nèi)腫瘤發(fā)育的啟動(dòng)過(guò)程，激活腫瘤新生血管的發(fā)生。Apelin（APJendogenousligand）是Tatemoto[8]于1998年從牛胃中分離提出發(fā)現(xiàn)的生物活性多肽，是G蛋白偶聯(lián)受體-血管緊張素II 1型受體相關(guān)蛋白（APJ）[9]的內(nèi)源性配體，二者相互結(jié)合發(fā)揮重要生物學(xué)功能[10]。在血管功能調(diào)節(jié)方面的研究發(fā)現(xiàn)，apelin/APJ系統(tǒng)在血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）和心肌細(xì)胞中高表達(dá)，并參與血管功能的調(diào)控和維持[11,12]。Apelin不僅具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[13]，還能夠通過(guò)促進(jìn)血管生成對(duì)心臟起到保護(hù)作用[14]，在心衰心肌重塑過(guò)程中起到了重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)apelin可以通過(guò)上調(diào)VEGF激活P70S6K來(lái)刺激血管新生[16]。而在肺癌細(xì)胞中，apelin通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）來(lái)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549的自噬和增殖[17]。Apelin在1/3的人類腫瘤中的表達(dá)明顯上調(diào)[18]，對(duì)包括肺癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌、前列腺癌和婦科腫瘤在內(nèi)的腫瘤患者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者apelin血清含量明顯高于健康人群[19]，并且apelin的含量與腫瘤的分期和有無(wú)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些證據(jù)表明apelin/APJ系統(tǒng)與腫瘤之間存在一定的相關(guān)性，在腫瘤細(xì)胞遷徙、增殖及血管形成上有重要作用[20]，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]。與肺癌相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，apelin在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織[22]，APJ在肺腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁支氣管黏膜下組織，血漿中apelin的表達(dá)在肺癌患者中顯著增高，提示apelin/APJ系統(tǒng)與肺腺癌存在相關(guān)性[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，apelin-13可以通過(guò)增加ERK的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)A549細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性[23]，表明apelin/APJ系統(tǒng)可能通過(guò)ERK信號(hào)通路介導(dǎo)了肺腺癌細(xì)胞的增殖和自噬。而且有研究顯示，apelin可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞間聚集、調(diào)節(jié)血管直徑[24]及血管生成，是人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中新的血管生成因子[22]。外源性和內(nèi)源性的apelin都具有促進(jìn)血管發(fā)生的作用，并且用apelin或APJ抑制劑阻斷apelin/APJ系統(tǒng)后，能有效的抑制血管發(fā)生[25]。

缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子是缺氧誘導(dǎo)因子家族，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過(guò)多種途徑上調(diào)HIF-1α的表達(dá)[26]，在缺氧條件下，HIF-1α可以誘導(dǎo)數(shù)種促血管發(fā)生分子的表達(dá)，apelin是其中之一[27]。在斑馬魚背鰭再生模型中，缺氧誘導(dǎo)apelin表達(dá)是必要條件[28]。在VEGFA-VEGFR2通路的下游，apelin/APJ系統(tǒng)傳遞信號(hào)功能，且能在鼠和人類腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到APJ[21,29]。因?yàn)閍pelin表達(dá)由缺氧和VEGF信號(hào)激活，有學(xué)者[30]利用Apln-CreER轉(zhuǎn)基因小鼠，成功示蹤了組織損傷修復(fù)以及腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的血管新生，并利用該工具小鼠阻斷血管新生和VEGFAVEGFR2信號(hào)通路，達(dá)到一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，apelin特異性地表達(dá)于腫瘤新生血管頂端的細(xì)胞，而該群細(xì)胞靠近腫瘤最缺氧的位置，這與以往的研究認(rèn)為apelin受到缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)控的結(jié)論一致。綜上可見，apelin/APJ系統(tǒng)與腫瘤臨床進(jìn)展密切相關(guān)，apelin/APJ系統(tǒng)在腫瘤血管發(fā)生和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著十分重要的角色，通過(guò)抑制apelin/APJ系統(tǒng)可以有效的抑制腫瘤血管和淋巴管的生成，從而達(dá)到靶向治療腫瘤的目的。

中醫(yī)扶正祛邪、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)平衡的理論治療腫瘤，促進(jìn)恢復(fù)機(jī)體陰陽(yáng)平衡，維持機(jī)體功能的協(xié)調(diào)，抑制腫瘤血管生成，對(duì)防治腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義。由于中藥復(fù)方的組分較為復(fù)雜，其抗腫瘤的、抗血管生成的作用是多靶點(diǎn)和多通道的[31]。我們臨床以益氣養(yǎng)精法配伍的主方治療非小細(xì)胞肺癌，君用黃芪、黃精以益氣健脾、補(bǔ)養(yǎng)肺衛(wèi)之精氣，臣以白術(shù)、女貞子、仙靈脾，補(bǔ)益脾腎之氣以增強(qiáng)益氣養(yǎng)精之功，佐七葉一枝花、干蟾皮等清解之品，兼以清熱解毒、化痰散結(jié)。臨床研究表明該方能夠穩(wěn)定晚期肺癌瘤體、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、提高患者的生存質(zhì)量、長(zhǎng)生存期，在抗肺癌轉(zhuǎn)移方面確有良好療效[32]，ELISA檢測(cè)表明該方能夠顯著降低患者血清VEGF水平[33]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，經(jīng)中藥益氣養(yǎng)精方處理的Lewis肺癌荷瘤鼠小鼠，其腫瘤MVD、VEGF表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組和化療組，表明該方可減少VEGF表達(dá)和降低腫瘤MVD以抑制腫瘤血管生成[33-34]。該方具有一定的抑制血管生成、抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

如前所述，缺氧能夠調(diào)控apelin/APJ系統(tǒng)，而apelin可以增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路，通過(guò)激活Smad3蛋白起到促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移。益氣養(yǎng)精方前期工作也表明，該方具有抑制肺癌血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移的作用，這與目前已了解到的apelin/APJ系統(tǒng)信號(hào)作用具有相似性，且益氣養(yǎng)精方對(duì)該通路中相關(guān)細(xì)胞因子（VEGF、HIF-1α等）及通路（PI3K/Akt）有一定的調(diào)節(jié)作用。因而我們推測(cè)益氣養(yǎng)精方可能通過(guò)調(diào)控apelin/APJ信號(hào)通路，起到抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，特進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞A549和H1975細(xì)胞株，購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，完全培養(yǎng)基由1640培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清（FBS）配制而成。

1.1.2 益氣養(yǎng)精方

方藥組成：生黃芪、白術(shù)、七葉一枝花、干蟾皮、女貞子、黃精、仙靈脾等組成，于中國(guó)科學(xué)院藥物研究所用乙醇提煉濃縮制備成復(fù)方凍干粉。

1.1.3 試劑

CoCl2工作液制（生工生物工程（上海）公司）；RMPI-1640培養(yǎng)液（HyClone公司）；PBS緩沖液（HyClone公司）；FBS（Gibco公司）；CCK-8試劑盒（凱基公司）；Matrigel基質(zhì)膠（BD公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊公司）。

1.1.4 抗體

Anti-apelin antibody（ab59469）、Anti-APJ receptor antibody（ab214369）、Anti-PI3K antibody（ab151549）、Anti-Akt-A antibody（Ab8805）、Anti-Smad3-A antibody（ab40854）、Anti-VEGF-A antibody（ab46154）、Anti-GAPDH-A antibody（ab8245）購(gòu)置于Abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)·mL-1，每孔100μL接種于96孔板；第2 d缺氧組加入CoCl2工作液制造乏氧微環(huán)境，終濃度為200μmol·L-1；第3 d加入益氣養(yǎng)精方，設(shè)置濃度梯度，每梯度3復(fù)孔；空白對(duì)照組為等體積的完全培養(yǎng)基。24 h后加入CCK-8，2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的OD值，觀察各干預(yù)組對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并計(jì)算常氧環(huán)境下的半數(shù)致死率（IC50）。

1.2.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞，接種于Transwell小室的上室中，分組同前，每組上室加入對(duì)應(yīng)等體積液體。培養(yǎng)箱孵育24 h后用棉簽擦去上室面的細(xì)胞，下室面的細(xì)胞在倒置顯微鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)下室面的細(xì)胞數(shù)，即為穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取其平均數(shù)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)各組的相關(guān)基因表達(dá)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔板，融合度達(dá)60-70%時(shí)，加藥處理。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置同前，設(shè)3復(fù)孔。加藥處理過(guò)程同劃痕實(shí)驗(yàn)，于24 h后收集細(xì)胞。裂解細(xì)胞后收集到離心管中，再加三氯甲烷，充分震蕩后靜置5 min，4℃、12000 rpm，離心10 min，小心吸取上清到新的離心管中，加入等體積異丙醇，-20oC放置1 h。4℃，12000 rpm離心10 min，得到RNA沉淀，用DEPC水溶解沉淀。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

RT-qPCR檢測(cè)apelin、APJ、VEGF-A、HIF-1α及Smad3的表達(dá)。內(nèi)參為Actin。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組相關(guān)蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞種植于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組同前，融合度達(dá)60-70%進(jìn)行干預(yù)，方法同前。24 h后，消化細(xì)胞收集于離心管，冰上裂解細(xì)胞，離心后收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣量，沸水變性。配膠，依次加入樣本、上樣緩沖液及內(nèi)參，電泳。激活PVDF膜，按正負(fù)極順序置入轉(zhuǎn)移裝置中，水浴轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜，TBST緩沖液沖洗后，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，再加入稀釋的一抗，4oC搖床孵育過(guò)夜。過(guò)夜后用TBST洗去未結(jié)合一抗，加入二抗稀釋液，室溫孵育2 h。將PVDF膜吸附蛋白的面朝上平鋪至暗盒，滴加適量發(fā)光試劑，鋪上保鮮膜，于暗室中壓片，進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間比較使用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 藥物濃度試驗(yàn)結(jié)果

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果提示，益氣養(yǎng)精方作用于A549、H1975兩種細(xì)胞株的IC50分別為1 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1（圖1（1）、1（2）），相同濃度益氣養(yǎng)精方干預(yù)后，乏氧較常氧微環(huán)境腫瘤細(xì)胞增殖更多（圖1（3）、1（4）），且隨著益氣養(yǎng)精方濃度的增加，對(duì)兩個(gè)細(xì)胞株的增殖抑制作用越明顯，在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率隨藥物濃度增加而逐漸降低。

圖1 乏氧微環(huán)境下不同濃度的益氣養(yǎng)精方對(duì)兩株細(xì)胞存活率的影響

2.2 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果

兩株細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)中，乏氧組下室面細(xì)胞數(shù)量均明顯多于空白對(duì)照組，結(jié)果提示有顯著差異，常氧益氣養(yǎng)精方組下室面細(xì)胞數(shù)量明顯少于空白組，結(jié)果提示有顯著差異（*P<0.05，**P<0.01）（圖2）。且同樣在乏氧環(huán)境下，雖然未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但可看出益氣養(yǎng)精方干預(yù)后的下室面細(xì)胞數(shù)略少于單純乏氧環(huán)境下的細(xì)胞數(shù)量。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

以Actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，乏氧組可見血管生成相關(guān)因子HIF-1α、VEGF、Smad3、Apelin及APJ較對(duì)照組均見不同程度高表達(dá)，多數(shù)有顯著差異；無(wú)論在常氧或乏氧微環(huán)境下，益氣養(yǎng)精干預(yù)后，各相關(guān)因子可見不同程度的表達(dá)下調(diào)，多數(shù)有顯著差異（*P<0.05，**P<0.01）（圖3）。

2.4 Western blot檢測(cè)

2.4.1 A549細(xì)胞株相關(guān)表達(dá)可見

常氧益氣養(yǎng)精方組，VEGF、PI3K、Akt、Apelin及APJ的表達(dá)量均明顯下降，Smad3的表達(dá)明顯上升；乏氧組，VEGF、PI3K及APJ的表達(dá)量明顯上調(diào)，Apelin的表達(dá)無(wú)明顯變化，而Smad3和Akt的表達(dá)量明顯下降；乏氧益氣養(yǎng)精方組中，Akt、Apelin的表達(dá)未見明顯差異，Smad3、PI3K表達(dá)量下降，VEGF、APJ的表達(dá)量增高（圖4）。

2.4.2 H1975細(xì)胞株相關(guān)表達(dá)可見

常氧益氣養(yǎng)精方組中，VEGF、Smad3、PI3K、Akt及Apelin的表達(dá)量均明顯下降，而APJ表達(dá)量升高；乏氧組，VEGF、Smad3、PI3K、Apelin及APJ的表達(dá)量明顯上調(diào)，而Akt的表達(dá)量明顯下降。乏氧益氣養(yǎng)精方組，VEGF、Smad3、PI3K、Akt及Apelin表達(dá)量下降，APJ的表達(dá)量增高（圖5）。

圖2 各干預(yù)組作用于兩株細(xì)胞24h后的侵襲轉(zhuǎn)移結(jié)晶紫染色結(jié)果（40×）

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組干預(yù)A549、H1975細(xì)胞株24h后相關(guān)因子HIF-1α、VEGF、Smad3、Apelin及APJ的表達(dá)

3 討論

通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)精方無(wú)論在常氧或是缺氧環(huán)境中，對(duì)于肺癌細(xì)胞A549和H1975的增殖均有抑制作用。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)精方無(wú)論在常氧或乏氧微環(huán)境中，對(duì)兩株細(xì)胞的侵襲能力均有一定抑制作用。在分子檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，乏氧環(huán)境下，這兩株細(xì)胞的血管生成相關(guān)因子HIF-1α、VEGF、Smad3、Apelin及APJ在RNA水平的表達(dá)，均較常氧環(huán)境的表達(dá)量高，而益氣養(yǎng)精方無(wú)論在常氧或乏氧環(huán)境中，對(duì)HIF-1α、VEGF、Apelin及APJ的表達(dá)均有一定的抑制作用，提示益氣養(yǎng)精方可能通過(guò)apelin/APJ系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的血管生成起到了一定的抑制作用。從蛋白水平上的表達(dá)來(lái)看，益氣養(yǎng)精方對(duì)該信號(hào)途徑中的相關(guān)因子VEGF、PI3K、Akt及Apelin的表達(dá)也具有一定的抑制作用，對(duì)于A549細(xì)胞的Smad3蛋白水平表達(dá)有促進(jìn)作用，H1975細(xì)胞的APJ蛋白水平也呈現(xiàn)出了高表達(dá)。在乏氧環(huán)境中，可以看到益氣養(yǎng)精方仍能發(fā)揮抑制相關(guān)因子表達(dá)的作用。因此通過(guò)兩種水平的不同分子表達(dá)的比較，以及分子間的上下游關(guān)系[35]，推測(cè)益氣養(yǎng)精方可以通過(guò)抑制Apelin的影響，對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生影響。

圖4 不同氧環(huán)境下益氣養(yǎng)精方對(duì)A549血管生成相關(guān)因子的蛋白表達(dá)作用

圖5 不同氧環(huán)境下益氣養(yǎng)精方對(duì)H1975血管生成相關(guān)因子的蛋白表達(dá)作用

值得說(shuō)明的是，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)精方于RNA水平下調(diào)了APJ的表達(dá)量，但是在蛋白水平上出現(xiàn)了上調(diào)的情況，而對(duì)于Smad3的表達(dá)調(diào)控，在RNA水平上與蛋白水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未一致，在蛋白水平上的表達(dá)較實(shí)驗(yàn)預(yù)期一致，這可能與不同細(xì)胞來(lái)源的個(gè)體差異相關(guān)，這些情況可能在轉(zhuǎn)錄后翻譯出現(xiàn)了某種變化，可能存在著某種轉(zhuǎn)錄后的修飾，使得蛋白水平表達(dá)受阻[36]，也有可能跟其上下游的生物學(xué)分子有一定的關(guān)聯(lián)。另外，在A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在常氧環(huán)境中，益氣養(yǎng)精方作用后Smad3在RNA水平上的表達(dá)上調(diào)，乏氧環(huán)境中，Smad3亦表達(dá)上調(diào)，而乏氧環(huán)境中益氣養(yǎng)精方作用后，Smad3的表達(dá)量卻明顯相對(duì)下調(diào)，可能是二者之間存在著某種反應(yīng)，進(jìn)而影響了Smad3的表達(dá)。這些都可以在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入的探究，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了新的思路。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們可以大致推導(dǎo)出，益氣養(yǎng)精方可以通過(guò)抑制Apelin的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路產(chǎn)生影響，促使肺腺癌細(xì)胞的血管生成相關(guān)因子表達(dá)下調(diào)，從而對(duì)非小細(xì)胞肺癌的血管生成產(chǎn)生影響，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲及轉(zhuǎn)移。