益氣活血中藥配伍對(duì)間歇性低氧復(fù)合胰島素抵抗細(xì)胞模型SREBP-1c/FAS信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)＊

馬林沁，張京春＊＊，劉 玥＊＊，喬 羽，毛 婷，雷舒雁，鄭喬仙，孫欣麗

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管病中心 北京100091；2.中國中醫(yī)科學(xué)院心血管病研究所 北京100091；3.北京市門頭溝區(qū)中醫(yī)院心肺科 北京102300；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京100020）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS）是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致以動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為基礎(chǔ)的各種心腦血管事件的發(fā)生[1,2]。OSAHS以長(zhǎng)期的睡眠中反復(fù)缺氧-復(fù)氧，即慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）為典型病理表現(xiàn)，CIH是OSAHS導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管并發(fā)癥的主要因素[3,4]。OSAHS可以導(dǎo)致以胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為核心機(jī)制的高血壓、肥胖及糖脂代謝異常的代謝綜合征患病率明顯升高，而各種代謝異常又與AS的發(fā)生發(fā)展有明顯的相關(guān)性[5]，研究表明OSAHS能夠放大糖脂異常對(duì)血管內(nèi)皮的損傷而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展，增加糖尿病或高脂血癥患者發(fā)生AS的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此推斷在OSAHS相關(guān)的AS中，CIH及IR可能是關(guān)鍵的作用機(jī)制。糖脂代謝異常是AS的重要危險(xiǎn)因素之一，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs）包 括SREBP-1和SREBP-2兩種；SREBP-1c是SREBP-1的異構(gòu)體之一，在肝臟、脂肪組織、骨骼肌、腎上腺等部位廣泛表達(dá)，主要參與調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪酸的生物合成。脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS）是其活化后調(diào)節(jié)的下游靶基因之一，主要介導(dǎo)脂肪酸的合成。SREBP-1c信號(hào)分子及其相關(guān)通路可能在CIH合并IR介導(dǎo)的AS過程中扮演了重要的角色[7]。

目前的中醫(yī)臨床及基礎(chǔ)研究提示我們，以益氣活血為治法，應(yīng)用具有益氣、活血功效的中藥，可能對(duì)OSAHS、IR、糖脂代謝異常、AS及相關(guān)心血管疾病產(chǎn)生綜合的、多靶點(diǎn)的干預(yù)效應(yīng)[8-12]。因此，我們選擇了人參皂苷Re（ginsenoside Re）、川芎嗪（tetramethylpyrazine or ligustrazine,TMP）分別作為益氣中藥人參和活血中藥川芎的代表有效成分。在課題組前期研究建立的間歇性低氧（intermittent hypoxia,IH）復(fù)合IR的細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，分別以不同濃度的上述中藥單體作用于IH+IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型，觀察其對(duì)IH刺激下的IR脂肪細(xì)胞的影響，并觀察SREBP-1c相關(guān)信號(hào)分子在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

3 T3-L1原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American type culture collection,ATCC）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

川芎嗪（TMP,Sigma 95162），人參皂苷Re（Ginsenoside Re,Sigma 77960），白樺脂醇（Betulin,Sigma B9757）。

H-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（HyClone,SH30022），胎牛血清（FBS,Gibco 10099141），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX,Sigma I5879），胰島素（Sigma I5500），地塞米松（DEX,Sigma D1756），磷酸緩沖鹽溶液（PBS,HyClone SH30256），葡萄糖檢測(cè)試劑盒（Sigma,GAGO20），CCK-8試 劑 盒（YEASEN 40203ES60），TRIzol Reagent（Invitrogen15596-026），Prime Script RT Master Mix（TaKaRa RR036A），SYBR Premix Ex Qaq II（TaKaRa RR420A），NuPAGE MOPS SDS Running Buffer（20×）（Thermo NP0001），iBlot Transfer Stack,Regular（Thermo IB301001），β-actin抗體（中杉金橋TA-09），GAPDH抗體（中杉金橋TA-08），SREBP-1抗體（Abcam ab28481），F(xiàn)AS抗 體（Abcam ab22759），NUPAGE 4-12%梯度預(yù)制膠（Invitrogen NP0321BOX），SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Thermo 34905）。引物序列（上海生工）：β-actin F 5′-CCATGTACGTAGCCATCCAG-3′；β-actin R 5′-GAGTCCATC ACAATGCCTGT-3′；SREBP-1c F 5′-TTGTGGAGCTCAAAGACCTG-3′；SREB P-1c R 5′-TGCAAGAAGCGGATGTAGTC-3′；FAS F 5′-AGTGCAAGTGCAAAC-CAGAC-3′；FAS R 5′-CATAGGCGATTTCTGGGACT-3′；IRS-1 F 5′-ATTAAAC-ACTGGGCCTCTGG-3′；IRS-1 R 5′-GCTGTGCCATACTCTCTCCA-3′；SOD mouse F 5′-AGGCTGTACCAGTGCAGGAC-3′；SOD R 5′-AGCAGTCACATTG CCCAGGT-3′；HIF-1αF 5′-TCAGCATACAGTGGCACTCA-3′；HIF-1αR 5′-GGTTAAGGCTCCTTGGATGA-3′。其他試劑還包括二抗、胰蛋白酶、DEPC水、異丙醇、TBST緩沖液(10×)、二甲基亞砜（DMSO）等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

低氧裝置Modular Incubator Chamber（MIC-101）（Billups-rothenberg），氧電極（Billups-rothenberg），超凈工作臺(tái)（Thermo），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Merck&Millipore），離心機(jī)（Thermo），光柵型多功能酶標(biāo)儀（Tecan），紫外分光光度計(jì)（Biophotometer），梯度PCR儀（Thermo），qPCR儀（ABI7500），iBlot Dry轉(zhuǎn)膜儀（Thermo），數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（BINTA），智能型倒置熒光顯微鏡（Leica）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)3T3-L1成纖維細(xì)胞分化為成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞[13]。3T3-L1細(xì)胞生長(zhǎng)至接觸融合后2 d，換分化液I（由完全培養(yǎng)基加0.5 mmol·L-1IBMX、5μg·mL-1胰島素、1μmol·L-1DEX組成）培養(yǎng)48 h，再換成分化液II（由完全培養(yǎng)基加5μg·mL-1胰島素組成）繼續(xù)培養(yǎng)8-11 d，每2 d換液1次。油紅O染色法驗(yàn)證3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化情況。

1.2.2 IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型的建立

首先建立IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型[14]。3T3-L1細(xì)胞分化為成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞后，用含DEX 1×10-6mol·L-1的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)處理96 h。葡萄糖氧化酶法（GOD-POD法）檢測(cè)培養(yǎng)基葡萄糖水平，qPCR檢測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素受體底物-1（Insulin receptor substrate,IRS-1）mRNA表達(dá)水平，以判斷IR脂肪細(xì)胞模型的建立。

1.2.3 IH+IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型的建立

應(yīng)用課題組前期摸索的細(xì)胞IH刺激方案[15]，按如下步驟進(jìn)行IH處理：①IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞換無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h。②低氧裝置MIC-101紫外照射消毒。③將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入低氧裝置MIC-101中：缺氧階段以低氧氣洗脫裝置倉中的空氣，氣體出口以氧電極監(jiān)測(cè)氧濃度，當(dāng)氧濃度達(dá)到5%時(shí)停止進(jìn)氣，關(guān)閉進(jìn)氣口及出氣口，維持低氧狀態(tài)1 min；復(fù)氧階段將氧氣通入裝置倉中，當(dāng)氧電極監(jiān)測(cè)出氣口氧濃度達(dá)到21%后停止進(jìn)氣，關(guān)閉進(jìn)氣口及出氣口，維持空氣氧濃度5 min；如此循環(huán)往復(fù)，處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞，缺氧操作及缺氧周期示意如圖1。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IH循環(huán)32次時(shí)，SREBP-1蛋白的表達(dá)水平明顯增高最明顯（P<0.05）（圖2），因此我們此次研究中給予IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞IH循環(huán)32次。

圖1 IH處理細(xì)胞示意圖

圖2 不同IH處理次數(shù)對(duì)SREBP-1蛋白表達(dá)水平的影響（n=6）

1.2.4 益氣活血中藥單體適宜干預(yù)濃度的分別篩選

（1）人參皂苷Re適宜干預(yù)濃度篩選

人參皂苷Re溶于DMSO配制成5μmol·mL-1的Re原液。分別用含人參皂苷Re 0μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1、100μmol·L-1、500μmol·L-1的培養(yǎng)基處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，以篩選細(xì)胞適宜的Re濃度用于下一步實(shí)驗(yàn)。

將IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞分為如下幾組進(jìn)行不同方式的處理：①常氧對(duì)照組（Con-Re）：將培養(yǎng)基換為無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4 h。②模型組（IH-Re）：將培養(yǎng)基換為無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，置于低氧裝置MIC-101內(nèi)，IH循環(huán)32次。③人參皂苷Re不同濃度組（Re0、Re1、Re10、Re100、Re500）：根據(jù)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果，選擇對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響的Re濃度，分別用含Re 0μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1、100μmol·L-1、500μmol·L-1的培養(yǎng)基預(yù)處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型24 h，然后將培養(yǎng)基換為無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，置于低氧裝置MIC-101內(nèi)，IH循環(huán)32次。

（2）TMP適宜干預(yù)濃度篩選

TMP溶于DMSO配制成10μmol·mL-1的TMP原液。分別用含TMP 0μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1、100μmol·L-1、1000μmol·L-1、10000μmol·L-1的培養(yǎng)基處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，以篩選細(xì)胞適宜的TMP濃度用于下一步實(shí)驗(yàn)。

將IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞分為如下幾組進(jìn)行不同方式的處理：1）常氧對(duì)照組（Con-TMP）：同上。2）模型組（IH-TMP）：同上。3）TMP不同濃度組（TMP0、TMP1、TMP10、TMP100、TMP1000）：根據(jù)細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果，選擇對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響的TMP濃度，分別用含TMP 0μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1、100 μmol·L-1、1000μmol·L-1的培養(yǎng)基預(yù)處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型24 h，然后將培養(yǎng)基換為無FBS的HDMEM培養(yǎng)基，置于低氧裝置MIC-101內(nèi)，IH循環(huán)32次。

圖3 分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞

表1 GOD-POD法測(cè)得的OD值比較（±s，n=12）

表1 GOD-POD法測(cè)得的OD值比較（±s，n=12）

注：72 h、96 h vs對(duì)照*P<0.05。

對(duì)照0.193±0.024*48 h 0.214±0.014 72 h 0.276±0.019*96 h 0.3262±0.026*

圖4 DEX不同處理時(shí)間對(duì)IRS-1的mRNA表達(dá)水平的影響（n=9）

1.2.5 益氣活血中藥單體聯(lián)合適宜干預(yù)濃度篩選

經(jīng)1.2.4所述步驟篩選出人參皂苷Re及TMP分別的可能有效濃度組成4種不同益氣活血中藥單體濃度組合：①Re1μmol·L-1+TMP1μmol·L-1、②Re1μmol·L-1+TMP10μmol·L-1、③Re10μmol·L-1+TMP1μmol·L-1、④Re10μmol·L-1+TMP 10μmol·L-1，重復(fù)上步實(shí)驗(yàn)篩選最適人參皂苷Re聯(lián)合TMP干預(yù)濃度。

分別配制成含有①Re1μmol·L-1+TMP1μmol·L-1、②Re1μmol·L-1+TMP10μmol·L-1、③Re10μmol·L-1+TMP1μmol·L-1、④Re10μmol·L-1+TMP 10 μmol·L-1，的4種培養(yǎng)基。將IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞分為如下幾組進(jìn)行不同方式的處理：1）常氧對(duì)照組（Con-Re+TMP）：同上。2）模型組（IH-Re+TMP）：同上。3）Re+TMP不同濃度組（Re1+TMP1、Re1+TMP10、Re10+TMP1、Re10+TMP10）：分別用上述①②③④4種培養(yǎng)基預(yù)處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型24 h，然后將培養(yǎng)基換為無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，置于低氧裝置MIC-101內(nèi)，IH循環(huán)32次。

1.2.6 益氣活血中藥單體聯(lián)合干預(yù)效應(yīng)及機(jī)制研究

SREBPs抑制劑為Betulin，將Betulin溶于DMSO配制成6 mg·mL-1的Betulin原液；經(jīng)1.2.5篩選出適宜的人參皂苷Re聯(lián)合TMP干預(yù)濃度作為益氣活血中藥單體聯(lián)合干預(yù)濃度。

將IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞分為如下幾組進(jìn)行不同方式的處理：1）常氧對(duì)照組（Con）：同上。2）模型組（IH）：同上。3）抑制劑組（Betulin）：Betulin以3μg·mL-1濃度加入到培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，將培養(yǎng)基換為無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，置于低氧裝置MIC-101內(nèi)，IH循環(huán)32次。4）益氣活血中藥組（Re+TMP）：以含Re1μmol·L-1、TMP10μmol·L-1的完全培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，將培養(yǎng)基換為為無FBS的H-DMEM培養(yǎng)基，置于低氧裝置MIC-101內(nèi)，IH循環(huán)32次。

1.2.7 指標(biāo)檢測(cè)

qPCR法檢測(cè)目的基因SREBP-1c、FAS及炎癥、氧化應(yīng)激等其他指標(biāo)包括IRS-1、白介素6（Interleukin,IL-6）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的mRNA表達(dá)水平。Western-blotting法檢測(cè)目的蛋白SREBP-1、FAS的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 IH+IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型的建立

3 T3-L1成纖維細(xì)胞分化至第8-11 d，細(xì)胞分化率可達(dá)到80%以上，認(rèn)為分化成熟，用于下一步實(shí)驗(yàn)（圖3）。GOD-POD法檢測(cè)DEX處理96 h后培養(yǎng)基葡萄糖水平高于未用DEX處理組（P<0.05）（表1），qPCR檢測(cè)DEX處理96 h后3T3-L1脂 肪細(xì)胞IRS-1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照減低（P<0.05）（圖4），認(rèn)為IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型成立。

2.2 益氣活血中藥單體的可能合適干預(yù)濃度篩選

在IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加以藥物干預(yù)及IH處理，篩選適宜的藥物干預(yù)濃度。

2.2.1 人參皂苷Re及TMP的可能合適干預(yù)濃度

CCK-8法測(cè)得的OD值比較如表2所示：不同濃度人參皂苷Re細(xì)胞活性差異不大（P>0.05）；而TMP濃度達(dá)到10000μmol·L-1細(xì)胞活性下降，與其他各濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 不同濃度中藥單體對(duì)細(xì)胞活性的影響（-x±s,n=12）

2.2.2 人參皂苷Re對(duì)SREBP-1c mRNA表達(dá)水平的影響

qPCR法檢測(cè)及比較Con-Re、IH-Re、Re0、Re1、Re10、Re100、Re500各 組IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞SREBP-1c mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示：IH-Re組SREBP-1c mRNA表達(dá)水平較Con-Re組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Re不同濃度對(duì)SREBP-1c表達(dá)水平影響不同，其中Re1組、Re10組降低SREBP-1c表達(dá)，與IH-Re組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 不同濃度Re對(duì)SREBP-1c mRNA表達(dá)水平的影響（n=9）

2.2.3 TMP對(duì)SREBP-1c mRNA表達(dá)水平的影響

qPCR法檢測(cè)及比較Con-TMP、IH-TMP、TMP0、TMP1、TMP10、TMP100、TMP1000各組IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞SREBP-1c mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖6所示：IH-TMP組SREBP-1c較Con-TMP組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），TMP不同濃度均能一定程度下調(diào)SREBP-1c表達(dá)水平，其中TMP1組、TMP10組與IH-TMP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 不同濃度TMP對(duì)SREBP-1c mRNA表達(dá)水平的影響（n=9）

2.3 Re聯(lián)合TMP的可能合適干預(yù)濃度

根據(jù)以上篩選結(jié)果，分別以不同濃度的Re+TMP（①Re1μmol·L-1+TMP1μmol·L-1、②Re1μmol·L-1+TMP10μmol·L-1、③Re10μmol·L-1+TMP1μmol·L-1、④Re10μmol·L-1+TMP 10μmol·L-1，）預(yù)處理IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h后進(jìn)行IH處理，qPCR法檢測(cè)SREBP-1c及其下游的FAS mRNA表達(dá)水平，并與常氧處理的Con-Re+TMP組及IH處理的IH-Re+TMP組比較，觀察其對(duì)SREBP-1c及下游FAS分子的不同干預(yù)效應(yīng)以篩選最合適的聯(lián)合作用濃度。結(jié)果如圖7所示：IH-Re+TMP組SREBP-1c、FAS mRNA表達(dá)水平較Con-Re+TMP組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Re+TMP不同濃度均能一定程度下調(diào)SREBP-1c、FAS mRNA表達(dá)水平，其中Re1+TMP10組、Re10+TMP1組SREBP-1c mRNA表達(dá)水平 與IH-Re+TMP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Re1+TMP10組FAS mRNA表達(dá)水平與IH-Re+TMP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 益氣活血中藥單體對(duì)IH+IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞的干預(yù)效應(yīng)

根據(jù)上步干預(yù)濃度篩選結(jié)果，選擇濃度為Re1 μmol·L-1+TMP10μmol·L-1的Re+TMP作為觀察濃度。分別比較Con組、IH組、Betulin組、Re+TMP組SREBP-1分子及其下游分子之一的FAS的蛋白表達(dá)水平，IRS-1 mRNA表達(dá)水平，及IL-6、SOD、HIF-1α等炎癥、氧化應(yīng)激信號(hào)分子mRNA表達(dá)水平。

圖7 不同濃度Re+TMP對(duì)SREBP-1c、FAS mRNA表達(dá)水平的影響（n=9）

Western-blotting法檢測(cè)SREBP-1、FAS蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖8所示：IH組SREBP-1、FAS蛋白表達(dá)水平較Con組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Betulin、Re+TMP能一定程度下調(diào)IH刺激下升高的SREBP-1、FAS蛋白表達(dá)水平，其中SREBP-1表達(dá)與IH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖8 Re+TMP對(duì)SREBP-1、FAS蛋白表達(dá)水平的影響（n=6）

IRS-1、IL-6、SOD、HIF-1αmRNA表達(dá)水平比較結(jié)果如圖9所示：IH組IRS-1 mRNA表達(dá)水平較Con組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Re+TMP組較IH組IRS-1 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IH組IL-6 mRNA表達(dá)水平較Con組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Betulin組、Re+TMP組較IH組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。IH組SOD mRNA表達(dá)水平較Con組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Re+TMP組較IH組SOD mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。IH組HIF-1αmRNA表達(dá)水平較Con組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Re+TMP組較IH組HIF-1αmRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

IR既是CIH引起的重要病理效應(yīng)之一，又是AS的重要致病因素，在CIH介導(dǎo)的AS過程中可能占有重要地位，是目前研究新的熱點(diǎn)之一[7]。中醫(yī)對(duì)IH的研究尚處于起步階段，基礎(chǔ)研究較少見；但由于IH屬于特殊類型的缺氧，而具有抗缺氧效用的中藥數(shù)目頗多，因此可以借其抗缺氧效應(yīng)試用于IH的研究。目前中醫(yī)中藥研究中常見的中藥、中藥提取物或有效成分等包括丹參、川芎、銀杏葉提取物、黃芪、人參、紅景天等[16-21]，可看出益氣藥、活血藥在抗缺氧中藥中占有重要地位。本研究選擇了人參皂苷Re及TMP分別作為益氣中藥人參和活血中藥川芎的代表中藥單體，探討其對(duì)IH復(fù)合IR的干預(yù)效應(yīng)及機(jī)制。

圖9 Re+TMP對(duì)IRS-1、IL-6、SOD、HIF-1αmRNA表達(dá)水平的影響（n=9）

本研究首先分別對(duì)人參皂苷Re和TMP對(duì)細(xì)胞活性和SREBP-1c信號(hào)分子的抑制作用進(jìn)行濃度篩選，參考相關(guān)細(xì)胞研究文獻(xiàn)[22-25]所提供的濃度并根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中兩種單體的溶解度等因素，分別選擇了人參皂苷Re 0μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1、100 μmol·L-1、500μmol·L-1及TMP 0μmol·L-1、1μmol·L-1、10μmol·L-1、100μmol·L-1、1000μmol·L-1、10000 μmol·L-1作為篩選濃度；并對(duì)其中效果較好的濃度進(jìn)行組合，最后選擇了對(duì)SREBP-1c、FAS mRNA表達(dá)抑制作用最強(qiáng)的人參皂苷Re 1μmol·L-1和TMP 10 μmol·L-1作為最優(yōu)干預(yù)藥物濃度，發(fā)現(xiàn)了人參皂苷Re和TMP配伍在體外具有一定的抑制IH條件下SREBP-1、FAS蛋白表達(dá)水平的上調(diào)、提高IRS-1及SOD mRNA表達(dá)水平、降低HIF-1αmRNA表達(dá)水平的效應(yīng)，即觀察到一定的改善IR、氧化應(yīng)激的效應(yīng)。

人參皂苷Re在改善IR、調(diào)節(jié)糖脂代謝方面的有效性已得到許多臨床研究及基礎(chǔ)研究的證實(shí)[26,27]，且具有改善氧化應(yīng)激、抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡等效應(yīng)[28,29]，近幾年也有研究報(bào)道了人參皂苷Re或含Re的人參提取物在人肝腫瘤細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）、3T3-L1脂肪細(xì)胞抑制SREBP-1c及其下游FAS等的效應(yīng)[30,31]。TMP是作為已長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床的藥物，在改善氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥、抗血小板聚集等方面有著較好的作用，因此得到中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病領(lǐng)域的廣泛認(rèn)可[32,33]。然而目前的研究都鮮有報(bào)道它們對(duì)IH引起的損傷效應(yīng)是否有改善作用，本研究在之前研究者的基礎(chǔ)上對(duì)此進(jìn)行探討，并首次觀察了這兩種中藥單體對(duì)IH引起的SREBP-1c及其下游FAS的表達(dá)升高的抑制作用。

SREBP-1c、IRS-1、HIF-1α之間相互影響，三者均可參與IH與IR的發(fā)生發(fā)展[34]，在既往研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本研究從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角度觀察了IH及Re+TMP對(duì)三者的作用，能在一定程度上解釋益氣活血中藥的單體成分改善IH及IR損傷效應(yīng)的部分機(jī)制，但對(duì)三者間相互影響的分子機(jī)制仍尚乏探討，有待于進(jìn)一步擴(kuò)展研究。課題組前期的研究在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞觀察到了IH有引起IL-6升高的效應(yīng)[15]，此次在IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞同樣觀察到了這樣的作用，但沒有觀察到Re+TMP有明顯的下調(diào)IL-6 mRNA表達(dá)水平的作用，既往研究中也罕見人參皂苷Re或TMP在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中下調(diào)IL-6的報(bào)道[35]，后續(xù)研究還可以從在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度或其他炎癥因子角度進(jìn)行進(jìn)一步探索。目前研究已有分別報(bào)道人參皂苷Re或TMP對(duì)SOD的調(diào)節(jié)作用[36-37]，本研究觀察到了二者聯(lián)合作用上調(diào)SOD mRNA表達(dá)水平的效應(yīng)，為Re+TMP改善氧化應(yīng)激作用提供了依據(jù)。

綜上，本研究在建立IH復(fù)合IR的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，探討了SREBP-1c信號(hào)分子及其下游的FAS在IH對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等損傷效應(yīng)中的作用，可能為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OSAHS相關(guān)心血管疾病的較新的藥物干預(yù)靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。研究以益氣活血常用中藥配伍（人參、川芎）的代表成分人參皂苷Re、TMP為干預(yù)藥物，在細(xì)胞水平驗(yàn)證了其效應(yīng)、探討了其機(jī)制。雖然研究尚處于初步階段，還有許多不足，但所得的研究結(jié)果具有一定的啟示意義，值得進(jìn)一步深化研究，期待為IH相關(guān)AS的中藥干預(yù)提供更有價(jià)值的依據(jù)。