蠐螬對激光損傷兔血-視網(wǎng)膜屏障后視網(wǎng)膜TekC、NGF表達(dá)的影響＊

蔣鵬飛，楊 霞，彭 俊，彭清華＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙410007；3.湖北航天醫(yī)院 武漢432000；4.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 長沙410208）

隨著激光在眼科檢查及治療的廣泛應(yīng)用，由激光所致的醫(yī)源性視網(wǎng)膜光損傷也越來越多，視網(wǎng)膜光損傷會(huì)破壞視網(wǎng)膜屏障功能，許多眼科疾病的發(fā)生與視網(wǎng)膜長期光照的積累效應(yīng)有關(guān)[1-2]。蠐螬在眼科應(yīng)用較早，《晉書》中有此藥治療目疾的記載：“吳中書郎戰(zhàn)沖，母王氏失明，婢取蠐螬蒸熟與食，王以為美，沖還知之，抱母慟哭，母目即開?！北狙芯刻接懥讼擉す鈸p傷血－視網(wǎng)膜屏障的作用及其機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用30只健康實(shí)驗(yàn)性兔，均為雄性，體重1.8-2.3 Kg（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第20-002號(hào)）。

1.2 藥品及試劑

蠐螬酸性水解液（參照譚涵宇所用制備方法[3]制取，具體為：蠐螬400 g，清洗10遍以上，浸泡一晚，后洗至無臭味。加蒸餾水5 kg，加37%HCl至pH值為2。高壓蒸汽鍋蒸2小時(shí)。紗布（4-5層）過濾，溶液中加40%NaOH至pH值為6.5-6.8。冷卻，隔水加熱，濃縮至1600 mL，裝瓶，壓蓋，蒸汽高溫滅菌，冷藏保存）、Harris蘇木素（湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：71020784）、PV9000型二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號(hào)：zb-5301）、細(xì)胞裂解液（江蘇碧云天，批號(hào)：P0013）、RIPA蛋白裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G2002）、ECL發(fā)光試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：G2014）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天，批號(hào)：P0006）、轉(zhuǎn)移緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司，G2017）、NGF一抗（武漢博士德生物工程有限公司）、TrkC一抗（武漢博士德生物工程有限公司）、羊抗兔二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)：GB23303）。

1.3 主要儀器及器械

眼科手術(shù)顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械有限公司）、眼底接觸鏡（蘇州醫(yī)療器械有限公司）、YZ/3三面鏡（蘇州醫(yī)療器械有限公司）、YZ5F裂隙燈照相機(jī)（蘇州醫(yī)療器械有限公司）、裂隙燈顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械有限公司）、AG204型電子天平（上海梅特勒—托利多儀器有限公司）、TD5-Ⅱ臺(tái)式離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）、SSW型電熱恒溫水槽（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、721分光光度計(jì)（上海第三儀器廠）、LKB8800超薄切片機(jī)（瑞典LKB公司）、多功能顯微鏡（西德OPTON公司）、Olympus光學(xué)顯微鏡（日本日立公司）、石蠟包埋機(jī)（日本日立公司）、LeicaMPS30照相系統(tǒng)（德國Leica公司）、Leica石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）、萊特532眼底激光治療儀（法國光太公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 激光損傷血－視網(wǎng)膜屏障動(dòng)物模型的建立

參照王曉英[4]、陳少軍[5]等造模方法并加以改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備：激光照射當(dāng)日用復(fù)方托吡卡胺眼藥水滴眼2次。造模方法：兔稱重，固定，20%烏拉坦1 g/kg耳緣靜脈注射全麻，將兔頭部固定于激光機(jī)前，以激光在視盤及有髓神經(jīng)纖維下視網(wǎng)膜處密集照射40個(gè)點(diǎn)，光斑緊鄰，最大間隔為100μm。光斑效應(yīng)為3級(jí)（中度～重度）[6]：中心白較濃或更濃，激光能量作用于內(nèi)核層。

2.2 動(dòng)物分組及給藥方法

30只實(shí)驗(yàn)性兔隨機(jī)抽取10只（20只眼）作為正常組，其余20只（40只眼）造成激光損傷血－視網(wǎng)膜屏障模型，并隨機(jī)分成模型組、蠐螬組，每組10只（20只眼）。

造模后第2天開始給藥，按照“人—?jiǎng)游矬w表面積等效劑量比值表”折算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥劑量，折算公式：W*成人用量（g）/動(dòng)物體重（kg），折算系數(shù)W=0.018，每組灌胃藥物詳情如下：正常組與模型組以0.9%生理鹽水2 mL灌胃，蠐螬組以蠐螬提取液2 mL灌胃，均為每日1次，每次0.56 g/100 g。

2.3 標(biāo)本采集方法

灌胃1周后，各組隨機(jī)抽取5只兔進(jìn)行標(biāo)本的采集和指標(biāo)的檢測，各組剩余的兔繼續(xù)同法灌胃至第2周結(jié)束，再行標(biāo)本的采集和指標(biāo)的檢測。

2.3.1 眼球壁標(biāo)本的采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物耳緣靜脈注射空氣處死，立即沿角膜緣作標(biāo)記后摘除眼球，生理鹽水沖洗干凈，在冰生理鹽水中于角膜緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)組織和玻璃體，在手術(shù)顯微鏡下找到激光斑所處視網(wǎng)膜，大于激光斑范圍約3 mm切除該處眼球壁，用4%多聚甲醛在4℃固定。

2.3.2 視網(wǎng)膜組織勻漿的采集制作

將依同法摘除的眼球壁在手術(shù)顯微鏡下剝離激光斑部位視網(wǎng)膜，用濾紙吸干水分，電子天平稱其濕重，再用雙蒸水按照濕重：體積=1：19配制成5%的視網(wǎng)膜勻漿液。

2.4 觀測指標(biāo)及其方法

2.4.1 眼底觀察及照相

造模后即刻作眼底照相；每日灌胃前用直接檢眼鏡查看眼底，觀察眼底情況，光凝后7天、14天再次眼底照相。

2.4.2 光鏡下HE染色觀察

經(jīng)脫水浸蠟，二甲苯溶液脫蠟2次，每次5 min，無水乙醇洗蠟1次，3 min，95%乙醇浸泡，3 min，85%乙醇浸泡，3 min，自來水洗，3 min，蘇木素染色，5 min，水洗去多余染液，3 min，75%乙醇鹽酸分色5 min，自來水洗藍(lán)化，5 min，1%伊紅染色，3 min，水洗去多余染液，3 min，80%乙醇Ⅰ分色脫水，1 min，85%乙醇Ⅱ分色脫水，1 min，無水乙醇Ⅰ脫水，1 min，二甲苯溶液透明，3 min，中性樹膠封片等步驟，在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色標(biāo)本視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。

2.4.3 神經(jīng)營養(yǎng)因子受體蛋白（TrkC、NGF）表達(dá)的免疫組化觀察

采用S-P免疫組化法檢測視網(wǎng)膜組織的TrkC、NGF表達(dá)：石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后切片，3%H2O2去離子水孵育5-10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS根據(jù)需要對組織切片進(jìn)行預(yù)處理，滴加兔來源的一抗，37℃孵育1-2小時(shí)，PBS沖洗，2分鐘×3次，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育20-30分鐘，PBS沖洗，2分鐘×3次，選用DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┻M(jìn)行封片，高放大倍率顯微鏡下觀察TrkC、NGF的表達(dá)。標(biāo)準(zhǔn)如下：免疫組織化后，細(xì)胞質(zhì)為棕色或深棕色為陽性標(biāo)記，使用高倍顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)視網(wǎng)膜視野用于圖像分析系統(tǒng)的分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 眼底照相

造模組與蠐螬組均有明顯激光斑，激光斑中心顏色呈濃白色，周邊見淺色一圈光暈，說明造模成功。造模后7天，蠐螬組激光斑色白，邊界尚清，未見中心色素形成，可見白點(diǎn)，少許玻璃體混濁；模型組激光斑呈白色，邊界較模糊，中心未見色素沉著，玻璃體混濁。造模后14天，蠐螬組激光斑范圍明顯縮小，大部分形成瘢痕組織，玻璃體少量混濁；模型組激光斑顏色變深，中心形成瘢痕組織，玻璃體仍見明顯混濁，說明出血未完全吸收。（圖1-6）

圖1 正常兔眼底照相

圖2 造模成功眼底照相

圖3 蠐螬組7天后

圖4 模型組7天后

圖5 蠐螬組14天后

圖6 模型組14天

3.2 HE染色

3.2.1 術(shù)后1周HE染色觀察

正常組視網(wǎng)膜色素上皮層、視桿視錐層、外核層、外從狀層、內(nèi)核層、內(nèi)從狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)神經(jīng)纖維層等各層結(jié)構(gòu)清晰正常（圖7）。模型組視網(wǎng)膜厚度顯著薄于正常組，組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞數(shù)目減少，視細(xì)胞萎縮變性，HE染色可見視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞不連續(xù)，視網(wǎng)膜的外層較薄，部分感光細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，且細(xì)胞核數(shù)量減少，大部分區(qū)域無外感光器核染色，一小部分區(qū)域可見聚集成團(tuán)的細(xì)胞核染色（圖8）。蠐螬組視網(wǎng)膜厚度明顯高于模型組，可以見到一部分視網(wǎng)膜色素上皮，感光細(xì)胞核的數(shù)量大于模型組，外從狀層、外核層、視桿視錐層的結(jié)構(gòu)厚于模型組，并且結(jié)構(gòu)更清晰（圖9）。

3.2.2 術(shù)后2周HE染色觀察

正常組較前無明顯變化。模型組視網(wǎng)膜厚度仍薄于正常組，視網(wǎng)膜組織細(xì)胞數(shù)目較前增多，結(jié)構(gòu)較前清楚（圖10）。蠐螬組視網(wǎng)膜厚度高于模型組，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊（圖11）。

圖7

圖8

圖9

圖10

圖11

3.3 TrkC的表達(dá)

3.3.1 術(shù)后1周TrkC的表達(dá)

正常組視網(wǎng)膜組織抗TrkC標(biāo)記的細(xì)胞淺染色，染色陽性主要位于外核層細(xì)胞（圖12），模型組視網(wǎng)膜組織TrkC在Müller細(xì)胞中呈陽性表達(dá)（圖13），蠐螬組視網(wǎng)膜組織TrkC呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性面積大，染色較深（圖14）。模型組、蠐螬組TrkC表達(dá)與正常組比較有顯著性差異（P<0.01）。見表1。

圖12

圖13

圖14

表1 各組TrkC面密度值的變化（±s×10-4）

表1 各組TrkC面密度值的變化（±s×10-4）

注：與正常組比較：*示P<0.05，**示P<0.01；與模型組比較：▲示P<0.05；▲▲示P<0.01。

組別正常組模型組蠐螬組n 5 5 5第1周3.46±2.89 44.24±22.68**118.54±27.94**▲▲第2周2.90±1.06 22.06±8.19**69.38±17.26**▲▲

3.3.2 術(shù)后2周TrkC的表達(dá)

正常組視網(wǎng)膜組織TrkC呈弱陽性表達(dá)，與1周前正常組無區(qū)別（圖15），模型組視網(wǎng)膜組織TrkC呈弱陽性表達(dá)，Müller細(xì)胞中著色較正常組深（圖16），蠐螬組視網(wǎng)膜組織TrkC呈弱陽性表達(dá)，可見少量陽性染色位于Müller細(xì)胞中（圖17）。各組TrkC表達(dá)均較1周前有所下降，蠐螬組與模型組之間有顯著性差異（P<0.01）。見表1。

圖15

圖16

圖17

3.4 NGF的表達(dá)

3.4.1 術(shù)后1周NGF的表達(dá)

正常組視網(wǎng)膜組織NGF染色呈陰性（圖18），模型組視網(wǎng)膜組織NGF呈陽性表達(dá)，主見于外核層Müller細(xì)胞外側(cè)端表達(dá)（圖19），蠐螬組視網(wǎng)膜組織NGF呈強(qiáng)陽性表達(dá)，但陽性部位多位于Müller細(xì)胞的外側(cè)端（圖20）。模型組與蠐螬組NGF表達(dá)均高于正常組且有顯著性差異（P<0.05），蠐螬組與模型組間有顯著性差異（P<0.05）。見表2。

圖18

圖19

圖20

表2 各組NGF面密度值的變化（±s×10-4）

表2 各組NGF面密度值的變化（±s×10-4）

注：與正常組比較：*示P<0.05，**示P<0.01；與模型組比較：▲示P<0.05。

組別正常組模型組蠐螬組n 5 5 5第1周12.15±3.71 53.26±14.49**75.60±23.87**▲第2周8.63±2.55 30.13±7.25**42.39±19.33*▲

3.4.2 術(shù)后2周NGF的表達(dá)

正常組視網(wǎng)膜組織NGF染色呈陰性（圖21），模型組視網(wǎng)膜組織NGF呈弱陽性表達(dá)，主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層（圖22），蠐螬組視網(wǎng)膜組織NGF呈陽性表達(dá)，主位于Müller細(xì)胞外側(cè)端及部分神經(jīng)纖維層，染色較其它組深，陽性面積較其余對照組大（圖23）。模型組、蠐螬組NGF表達(dá)均較1周前有所下降，模型組與正常組間比較有顯著性差異（P<0.05），蠐螬組表達(dá)高于模型組，并且有顯著性差異（P<0.05）。見表2。

圖21

圖22

圖23

4 討論

隨著激光對血－視網(wǎng)膜屏障損傷機(jī)理研究的不斷深入，對于損傷后的治療，國內(nèi)外已經(jīng)從簡單的抗炎、止痛等對癥治療轉(zhuǎn)向探索更有針對性的治療方法，目前研究的重點(diǎn)主要集中在激素類、神經(jīng)保護(hù)劑和某些細(xì)胞因子的應(yīng)用研究。激素類主要是通過抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維持細(xì)胞完整性，防止細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流[6]，在激光照射后短時(shí)間內(nèi)具有神經(jīng)保護(hù)作用，但是對長期損傷沒有治療作用。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）和重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（Recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF）可加速視網(wǎng)膜損傷斑的修復(fù)愈合、維持神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的功能以及視功能的恢復(fù)[7-8]，對激光視網(wǎng)膜損傷斑有明顯的促進(jìn)修復(fù)愈合作用，可使損傷斑變淺淡，色素沉著減少，視網(wǎng)膜損傷斑面積明顯縮小，愈合修復(fù)較快。二甲基硫脲（Dimethyl thiourea，DMTU）可以有效地抑制感光細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，能明顯減少損傷區(qū)域視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡數(shù)目，保護(hù)視網(wǎng)膜組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)[9]。目前神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)劑尚處于研究、實(shí)驗(yàn)階段，其作用和不良反應(yīng)正在探索之中。盡管新的視網(wǎng)膜光損傷治療方法不斷問世，但很多都處于起始階段，其使用方法和療效有待進(jìn)一步的研究和證明，在臨床上尚缺乏有針對性的有確切療效的西藥。目前的主要治療原則是：撤離照射環(huán)境，及時(shí)對癥處理，營養(yǎng)支持治療，促進(jìn)組織修復(fù)，縮短致傷病程，恢復(fù)功能狀態(tài)。如加強(qiáng)全身營養(yǎng)，補(bǔ)充富含多種維生素的食物，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力等，有利于調(diào)節(jié)眼內(nèi)的正常代謝，增強(qiáng)局部抗損傷能力。

在祖國醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中并無“激光損傷血－視網(wǎng)膜屏障”病名的記載，但早在《備急千金藥方·卷六·七竅門上》中就記載了“…數(shù)看日月、夜視燈火…，并是喪明之本”；《外臺(tái)秘要》進(jìn)一步提到“數(shù)向日月輪看”、“雪山巨睛視日”皆是“喪目之由”，明確提出光損傷對視力的損害?，F(xiàn)代中醫(yī)眼科在繼承傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上，將激光損傷歸為:“為物所傷之病”范疇，認(rèn)為激光致血－視網(wǎng)膜屏障損傷主要是由于熱灼陰津、熱灼血絡(luò)，氣津相關(guān)，氣能生津、化津、攝津，津能載氣，若陰津虧耗，無以載氣，則氣失依附而氣散氣耗而致氣虛；氣生于精，精化為氣，陰精虧耗必致氣虛；陰損耗氣而致氣陰兩虛，氣為血帥，氣行血行，若氣虛運(yùn)血無力，可致氣虛血瘀。

蠐螬是金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子或其他近緣昆蟲的干燥幼蟲，屬蟲類藥，味咸微溫，有毒。有破血、行瘀、散結(jié)、通乳之功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早有記載：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅(jiān)滿痛，月閉，目中淫膚、青翳白膜?！薄秳e錄》稱蠐螬可以“療吐血在胸腹不去及破骨踒折血結(jié)，金瘡內(nèi)塞，產(chǎn)后中寒，下乳汁?！薄侗静菔斑z》中記載蠐螬“主赤白游疹，疹擦破，碎蠐螬取汁涂之。”現(xiàn)代研究認(rèn)為蠐螬含有多種對人體健康有益的元素：蠐螬中Ca、Mg、Cr、Fe、Zn的含量高是其重要的營養(yǎng)特征，Cu、Mn含量也非常豐富，蠐螬中K/Na的高比值對于防治心腦血管疾病有重要意義。從蠐螬中維生素含量測定結(jié)果看，B族維生素含量較高，維生素A和維生素E的含量也較豐富。維生素B1和煙酸能促進(jìn)血液循環(huán)，維生素B2能緩解眼睛疲勞、預(yù)防白內(nèi)障，維生素A有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用,維生素E是抗氧化維生素。對蠐螬滴眼液中氨基酸成分的測定結(jié)果顯示，其含有大量天門冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸，與Zn、Fe、維生素E等作用，可以緩解組織缺氧缺血，可能對血-視網(wǎng)膜損傷后組織的修復(fù)產(chǎn)生保護(hù)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜組織光損傷可導(dǎo)致感光細(xì)胞的存活率下降[10-11]，這與神經(jīng)營養(yǎng)因子（Neurot rophic factors，NTFs）有很大關(guān)系，NTFs在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的生長、生存以及成熟都是必不可少的[12]。神經(jīng)生長因子（Nervegrowthfactor，NGF）是NTFs蛋白家族的一員，在視皮質(zhì)中的NGF能穩(wěn)定丘腦傳入的突觸接觸[13]，成熟NGF和NGF原蛋白（proNGF）的免疫反應(yīng)性出現(xiàn)在大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)以及與內(nèi)界膜相鄰的視網(wǎng)膜區(qū)域，有研究推測NGF可能在正常視網(wǎng)膜功能執(zhí)行中發(fā)揮作用[14]，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、RPE細(xì)胞中均具有NGF受體[15]。NTFs作用主要是通過高親和型酪氨酸蛋白激酶類受體（High-affinity tvrosine kinase receptors，Trks）和p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體（The low-affinity neurotrophin receptor，p75NTR）完成的。當(dāng)NGF與Trks結(jié)合后，胞外區(qū)構(gòu)象變化導(dǎo)致受體的寡聚化活化，使胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶活性增高，然后通過Ras通路激活Raf21蛋白，隨后在細(xì)胞質(zhì)中促分裂因子激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）等一系列激酶被活化后的信號(hào)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并作用于一系列的靶蛋白（包括轉(zhuǎn)錄因子），從而影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表現(xiàn)為對細(xì)胞生長的調(diào)控，這樣NGF通過TrkC就可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞生長分化信號(hào)，從而使NGF表現(xiàn)出多種生物功能[16]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激光損傷視網(wǎng)膜血-視網(wǎng)膜屏障時(shí)NGF與Trks同時(shí)表達(dá)，而蠐螬能有效上調(diào)NGF與TrkC的表達(dá)，從而抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，保護(hù)細(xì)胞正常功能。提示蠐螬對激光所致視網(wǎng)膜血-視網(wǎng)膜屏障損傷有保護(hù)作用，能促進(jìn)損傷后視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，維護(hù)正常視功能。