基于化學(xué)成分相互作用研究大黃-甘草配伍應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)＊

陳艷琰，曹玉潔，唐于平，＊＊，陳嘉倩，樂世俊，李佳佳，康 安，周桂生，段金廒

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中醫(yī)藥管理局中藥配伍重點(diǎn)研究室，陜西 西安712046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京210023）

大黃-甘草是臨床常用經(jīng)典配伍組合，其配伍應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史。方劑中使用大黃-甘草配伍的例子頗多，如《金匱要略》所載大黃甘草湯（4:1）、《傷寒論》所載調(diào)胃承氣湯（2:1）。對(duì)中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)組成含有大黃-甘草的方劑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，大黃-甘草配伍頻次為2361次，共有93個(gè)配伍比例，其中大黃-甘草配比1:1出現(xiàn)頻數(shù)最高，其次為2:1、3:1、1:2、4:1、3:2[1]。對(duì)于大黃-甘草配伍的研究主要基于藥物效應(yīng)、體內(nèi)代謝、腸道菌群、化學(xué)成分等[2-5]，但對(duì)其化學(xué)成分的研究多集中在甘草對(duì)于大黃中化學(xué)成分的影響，少有研究大黃對(duì)甘草中化學(xué)成分變化的影響及系列配伍下的變化規(guī)律。本文以大黃-甘草配伍組合為研究對(duì)象，采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)（UPLC-TQ/MS），研究在臨床常用不同配比下化學(xué)成分相互作用導(dǎo)致的大黃及甘草中主要功效物質(zhì)變化特點(diǎn)，為揭示大黃-甘草配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Acquity超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），Xevo TQ質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），MassLynxTM質(zhì)譜工作站軟件（美國(guó)Waters公司），超純水機(jī)（南京易普易達(dá)科技公司），超聲波清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司），Micofuge 22R Centrifuge型臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）。

1.2 藥材與試劑

大黃產(chǎn)于甘肅省甘南，甘草產(chǎn)于寧夏靈武市，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝教授鑒定，分別為唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.）的干燥根及根莖，烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）的干燥根及根莖。大黃酸等17個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都瑞芬思科技有限公司，純度>98%。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

大黃、甘草飲片打粉（過40目篩），按照大黃：甘草4:0、4:1、4:2、4:3、4:4、3:4、2:4、1:4、0:4稱取9個(gè)配比的樣品。甘草8倍量水先回流提取60 min，后加入8倍量水浸泡30 min的大黃及其浸出液，回流提取5 min，過濾；藥渣再次用8倍、6倍量水提取各5 min，過濾、合并3次濾液[6]。9個(gè)配比的濾液各取1mL，分別加甲醇定容至10 mL，0.22μm濾膜過濾，得各供試液，平行制備3份。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品，以90%的甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為大黃酸15.404μg·mL-1、大黃素15.035μg·mL-1、蘆薈大黃素15.603μg·mL-1、大黃酚12.766μg·mL-1、大黃素甲醚18.440μg·mL-1、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷19.106μg·mL-1、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷14.479μg·mL-1、番瀉苷A 17.872μg·mL-1、番瀉苷B 17.376μg·mL-1、甘草酸19.191μg·mL-1、甘草次酸15.349μg·mL-1、甘草苷14.346μg·mL-1、異甘草苷23.546μg·mL-1、甘草素22.929μg·mL-1、異甘草素25.199μg·mL-1、甘草查耳酮A 15.085μg·mL-1、光甘草定23.005μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.3 色譜條件

Thermo Scientific Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫條件0-1 min，5% B；2-4 min，5%-35% B；4-8 min，35%-95% B；8-13 min，95% B；13-14 min，95%-5%B；14-15 min，5%B；流速0.4 mL·min-1，柱溫35℃，進(jìn)樣體積2μL。

2.4 質(zhì)譜條件

ESI離子源，離子源溫度150℃，多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），毛細(xì)管電壓3.0 kV，去溶劑氣溫度150℃，去溶劑氣流量1000 L·h-1，錐孔氣流量30 L·h-1，碰撞氣流量0.15 mL·min-1。各成分保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 大黃和甘草中17個(gè)成分的質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系：取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次進(jìn)樣分析；以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。信噪比為10、3時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為定量限（LOQ）、檢測(cè)限（LOD）。

精密度：取一份混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，以及連續(xù)3天內(nèi)每天重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察日內(nèi)及日間精密度。

重復(fù)性：平行制備大黃-甘草1∶1的供試品溶液6份，依次進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分峰面積的RSD值，考察儀器的重復(fù)性。

穩(wěn)定性：在1、2、4、8、12、24 h時(shí)分別進(jìn)樣大黃-甘草1∶1的供試品溶液，計(jì)算各成分峰面積的RSD值，考察樣品的穩(wěn)定性。

加樣回收率：在已知17個(gè)成分含量的樣品中加入其含量80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，加樣回收率=（加標(biāo)樣品濃度-樣品濃度）/加標(biāo)量。

3 結(jié)果

3.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、梯度洗脫程序、質(zhì)譜條件等優(yōu)化，獲得大黃和甘草中大黃酸等17個(gè)成分的UPLC-TQ-MS圖，見圖1。

3.2 方法學(xué)考察

對(duì)本文建立的UPLC-TQ-MS進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果見表2和表3。17種成分線性關(guān)系良好，r2均大于0.9984；標(biāo)準(zhǔn)品定量限范圍為0.908 ng·mL-1-57.720 ng·mL-1，檢測(cè)限范圍為0.454 ng·mL-1-11.540 ng·mL-1。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，RSD均小于3%；17種成分回收率在98.16%-100.64%范圍內(nèi)。

3.3 不同配比大黃-甘草中各成分的溶出度變化

對(duì)大黃-甘草各配比下大黃酸等17種成分的溶出量測(cè)定，計(jì)算樣品的進(jìn)樣濃度，考慮藥材重量、提取液體積、樣品稀釋倍數(shù)等因素，計(jì)算各成分的溶出量變化。以甘草酸為例，甘草酸的溶出度=（進(jìn)樣濃度×樣品稀釋倍數(shù)×提取液體積）/甘草重量。大黃中9種成分的溶出度變化如圖2，甘草中8種成分的溶出量變化如圖3。

4 討論

大黃-甘草多個(gè)配比中17個(gè)化學(xué)成分的溶出結(jié)果表明，各成分的溶出存在一定的相互作用且具有一定的規(guī)律性。在大黃：甘草4∶0、4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、3∶4、2∶4、1∶4、0∶4這9個(gè)配伍比例下，甘草能促進(jìn)大黃中主要游離蒽醌（大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚）、結(jié)合蒽醌（大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖）及蒽酮（番瀉苷A、番瀉苷B）的溶出；而大黃能促進(jìn)甘草中主要三萜（甘草酸、甘草次酸）及主要黃酮（異甘草苷）的溶出，抑制部分黃酮（甘草素、異甘草素、甘草查爾酮）的溶出。

大黃中蒽醌及蒽酮類被認(rèn)為是大黃瀉下的主要成分[6-8]，甘草中的三萜類及黃酮類被認(rèn)為是甘草發(fā)揮清熱解毒、緩急止痛的主要成分[9]。甘草中的三萜皂苷類成分具有表面活性作用，能促進(jìn)其他成分的溶出[10]。本研究結(jié)果證實(shí)甘草能促進(jìn)大黃中游離蒽醌、結(jié)合蒽醌及蒽酮類的溶出，隨甘草比例增加溶出度明顯升高，在大黃-甘草1∶4下尤為顯著；而在大黃-甘草4∶1下，大黃能促進(jìn)甘草中主要三萜及主要黃酮的溶出。大黃-甘草的化學(xué)成分相互作用從物質(zhì)基礎(chǔ)角度揭示了含大黃-甘草的經(jīng)典名方組方原理。如用于通腑泄熱、和胃止嘔的大黃甘草湯，方中大黃∶甘草為4∶1，此比例下甘草對(duì)大黃中蒽醌及蒽酮類物質(zhì)的溶出影響并不大，大黃酚有所下降、大黃酸有所增加；而大黃對(duì)甘草中甘草酸、甘草次酸、異甘草苷的溶出則有顯著的促進(jìn)作用，此前一直認(rèn)為兩藥合煎甘草可降低大黃中蒽醌的溶出而緩和其峻猛瀉下作用[11-12]，本研究發(fā)現(xiàn)甘草酸、甘草次酸、異甘草苷的溶出增加可能是甘草調(diào)和大黃使其通滯瀉下而不傷正的機(jī)理之一。如用于緩下熱結(jié)的調(diào)胃承氣湯，方中大黃-甘草為2∶1，此比例下甘草對(duì)大黃中蒽醌及蒽酮類物質(zhì)的溶出影響也不大，而大黃對(duì)甘草中主要三萜及黃酮的溶出也有顯著的促進(jìn)作用，即此方中的甘草并不主要發(fā)揮緩瀉作用，而是因?yàn)橛谜{(diào)胃承氣湯者一般有明顯高熱癥狀，依張仲景用藥經(jīng)驗(yàn)，大凡有熱必用甘草，取其清熱解毒、緩和病勢(shì)之功效[13]。

圖1 UPLC-TQ-MS分析大黃和甘草中17個(gè)成分的MRM圖

表2 大黃和甘草中17個(gè)成分的線性回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

表3 大黃和甘草中17個(gè)成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率測(cè)定結(jié)果

圖2 大黃中9種成分溶出度變化

圖3 甘草中8種成分溶出度變化

中藥方劑藥效的發(fā)揮與煎煮方法關(guān)系甚大，清代醫(yī)學(xué)家徐大椿說：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此”?！吨袊?guó)藥典》2015版提出大黃用法為“用于瀉下不宜久煎”，在煎煮大黃時(shí)主要參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[14]煎藥操作方法“后下藥應(yīng)當(dāng)在第一煎藥料即將煎至預(yù)定量時(shí)，投入同煎5-10 min”。大黃屬于有效成分受熱不穩(wěn)定藥物，其結(jié)合蒽醌及蒽酮久煎后多被破壞[15-17]，故在考察大黃-甘草配伍過程中化學(xué)成分變化時(shí)，采用了大黃后下共煎并提取3次的方法，以保證有效成分的最大溶出而又不至被破壞，從而很好地還原大黃古今用藥規(guī)律。

中藥配伍煎煮過程中由于各類型化學(xué)成分間的相互作用可能導(dǎo)致其中化學(xué)成分的溶出度變化，從而使效應(yīng)發(fā)生一定改變，影響臨床用藥的合理性與有效性。甘草配伍應(yīng)用發(fā)揮的功效與其物質(zhì)基礎(chǔ)有關(guān)，分析含大黃-甘草的2361首方劑，大黃：甘草≥1∶1時(shí)，功效頻次為止痛689次、清熱674次、利水552次[1]，此時(shí)甘草比例低于大黃，大黃中主要蒽醌及蒽酮的溶出變化并不顯著，而甘草中主要三萜及黃酮的溶出有顯著增加，主要發(fā)揮甘草的止痛、清熱之功及大黃的清熱、利水之效；大黃：甘草<1∶1時(shí)，各功效頻次均小于100次，此時(shí)甘草比例高于大黃，大黃中主要蒽醌及蒽酮的溶出明顯增加，而甘草中主要三萜及黃酮的溶出變化不明顯，主要發(fā)揮甘草的調(diào)和作用。因此，從大黃-甘草合煎過程不同配比化學(xué)成分與效應(yīng)關(guān)聯(lián)的角度研究?jī)伤幣湮樘卣骺稍谝欢ǔ潭壬辖沂緝伤幗M方的規(guī)律，也為中藥組方原理的揭示提供了思路與方法的參考。