基于網(wǎng)絡藥理學的枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的分子機制研究＊

但文超，何慶勇＊＊，曲 藝，李安琪，郭建波，丁宇坤

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京100053；2.北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京100029）

血脂異常是臨床常見的代謝性疾病之一，是心血管疾病發(fā)生的高危因素[1]。中國成人總體血脂異常患病率高達40.40%[2]，但我國成人血脂異常患者的知曉率和治療率仍處于較低水平。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的7種他汀類藥物雖然可以降低大多數(shù)患者低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Chesterol，LDL-C）水平，但部分患者對他汀類藥物仍存在不耐受，依從性低或耐藥的情況，從而導致預后不良[3]。

中藥復方調(diào)治血脂異常的優(yōu)勢不可小覷，其調(diào)治機制具有靶點多位、層次豐富、療效穩(wěn)固、安全性高等特點，尤其是在改善癥狀方面擁有極大潛力。網(wǎng)絡藥理學是醫(yī)學、生物學、計算機科學、生物信息學等多學科基礎理論與研究手段整合的結(jié)果，能夠系統(tǒng)綜合地反映藥物對疾病網(wǎng)絡的干預機制。這與中醫(yī)藥論治的整體動態(tài)性原則及復方多成分、多靶點、多途徑互相作用的特點有很強的趨同性。所以網(wǎng)絡藥理學可為中藥復方作用機制研究提供嶄新的、強有力的技術(shù)支持，這有助于揭示中藥復方科學內(nèi)涵、發(fā)現(xiàn)藥物靶標、指導中藥新藥研發(fā)、傳承和發(fā)展中醫(yī)藥理論[4]。

為此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，從枳術(shù)丸的物質(zhì)基礎出發(fā)，著眼于整體角度分析枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的分子機制，同時為后續(xù)研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 枳術(shù)丸相關靶點篩選

通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學平臺[5]尋找3味中藥化學組成成分，根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的2個ADME屬性值進行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點，并根據(jù)已發(fā)表的文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點。篩選結(jié)束后，為標準化蛋白質(zhì)靶點信息，統(tǒng)一在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點進行規(guī)范。

1.2 血脂異常相關靶點篩選

以“hyperlipidemia”、“hypercholesterolemia”“hypertriglyceridemia”等與血脂異常相關的疾病為關鍵詞，挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）、TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)中調(diào)治血脂異常的潛在靶點，進入DRUGBANK數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca）尋找調(diào)治血脂異常的臨床一線西藥作用靶點予以補充[6]。在Genecards數(shù)據(jù)庫中，Score值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系密切。根據(jù)經(jīng)驗，若靶點過多則設定Score大于中位數(shù)的目標靶點為血脂異常的潛在靶點，合并4個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復值得到血脂異常靶點。

1.3 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點PPI網(wǎng)絡構(gòu)建

為明晰枳術(shù)丸藥物相關靶點與血脂異常靶點間的相互作用，利用R語言將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。進而將交集靶點提交至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡模型[7]，將生物種類設定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence”（>0.9），其余設置均為默認設置，得到PPI網(wǎng)絡，并通過CytoScape3.7.1中的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡進一步分析，得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊，并通過分析其參與的生物學進程對其功能進行描述。

1.4 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點功能與通路的富集分析

Metascape平臺（http://metascape.org/gp/index.html）擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料[8-9]。將枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的靶點錄入Metascape平臺，設置P<0.01，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析，保存數(shù)據(jù)結(jié)果并采用Origin Lab 2018對數(shù)據(jù)進行可視化[10]。

1.5 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

運用CytoScape3.7.1構(gòu)建枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點-通路網(wǎng)絡圖，利用CytoScape3.7.1內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closenesss）等，并根據(jù)網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)判斷核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對接驗證

分析得到枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點網(wǎng)絡圖中度值排名前4的靶點，查找其PDB ID，登入Systems Dock Web Site（http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）將4個靶點與枳術(shù)丸活性成分進行對接[11]，根據(jù)Docking Score值評價靶點與活性化合物的結(jié)合強度與活性。

2 結(jié)果

2.1 枳術(shù)丸活性成分靶點的獲取

初步提取白術(shù)化學成分55種、枳實化學成分65種、荷葉化學成分93種，經(jīng)ADME篩選后共獲得白術(shù)4種、荷葉14種、枳實17種活性成分，包括山柰酚、槲皮素、柚皮素、木犀草素等，見表1。白術(shù)成分作用靶點19個、荷葉成分作用靶點103個、枳實成分63個，合并后刪除重復值共得到靶點116個。

2.2 血脂異常相關靶點的獲取

從Genecards數(shù)據(jù)庫獲得高膽固醇血癥靶點1087個、高甘油三酯血癥靶點1021個、高血脂癥靶點1130個。根據(jù)經(jīng)驗設定Score大于中位數(shù)的目標靶點為血脂異常的潛在靶點，如通過GeneCards所得高血脂癥靶點Score最大值為203.52，最小值為0.02，中位數(shù)為2.58，故設定Score>2.58的靶點為高血脂癥的潛在靶點。結(jié)合OMIM、TTD、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補充相關靶點，合并后刪除重復值，最終得到1219個血脂異常相關靶點。

表1 枳術(shù)丸主要成分

2.3 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建

將篩選的枳術(shù)丸活性成分靶點與血脂異常疾病靶點取交集，并通過R語言繪制韋恩圖，得到枳術(shù)丸成分-血脂異常共同靶點60個，見圖1。進而將靶點提交至STRING11.0平臺，得到枳術(shù)丸靶點PPI網(wǎng)絡，見圖2。

由于PPI網(wǎng)絡中蛋白的作用的是相互的，所以通常歸為無向圖。PPI復雜網(wǎng)絡中存在部分密度較高的區(qū)域稱為community或module。module內(nèi)部的網(wǎng)絡是PPI網(wǎng)絡的潛在子網(wǎng)，子網(wǎng)連線密度較高，區(qū)域部分連線少，因此module被認為是具有生物學意義的集合，該集合有2種含義，一為蛋白質(zhì)復合體（protein complex），即多個蛋白質(zhì)共同組成復合體而后發(fā)揮生物學作用；一為功能模塊（functional module），如位于同一通路的蛋白質(zhì)，其相互作用更加密切[12]。故為更精確地分析枳術(shù)丸治療血脂異常的作用機制，在得到枳術(shù)丸PPI網(wǎng)絡后，有必要進一步識別其內(nèi)在module。

得到PPI網(wǎng)絡后，運用CytoScape3.7.1中的MCODE插件，通過分子復合物檢測算法對相互作用關系進行分析，得到module，見圖3。根據(jù)P值,分別保留PPI網(wǎng)絡與Module中3個最佳評分的生物學進程對其進行功能描述，見表2。

圖1 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點韋恩圖

圖2 枳術(shù)丸-血脂異常靶點PPI網(wǎng)絡

表2 枳術(shù)丸-血脂異常靶點PPI網(wǎng)絡功能描述

2.4 靶點功能與通路的富集分析

應用Metascape數(shù)據(jù)平臺對枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常相關靶點進行信號通路分析，借助Origin Lab 2018對結(jié)果可視化。由結(jié)果可見多個靶點的功能與血脂異常的產(chǎn)生密不可分。枳術(shù)丸主要參與的生物學過程包括生物對營養(yǎng)元素的應答過程（response to nutrient levels）、類固醇代謝進程（steroid metabolic process）、生長調(diào)控（regulation of growth）、肌細胞增殖（muscle cellproliferation）、對脂多糖的應答（response tolipopolysaccharide）、細胞對脂質(zhì)的應答（cellular response to lipid），見圖4（A），參與的通路主要有AGERAGE信號通路、HIF-1信號通路以及脂肪細胞中脂肪分解的通路等，見圖4（D），靶點通路富集結(jié)果見表3。

相關靶點調(diào)節(jié)血脂的功能主要富集于類固醇激素受體活動（steroid hormone receptor activity）、輔因子結(jié)合（cofactor binding）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合（NADP binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、絲氨酸水解酶活動（serine hydrolase activity），生長因子的結(jié)合（growth factor receptor binding）等，見圖4（B）。

2.5 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

運用CytoScape3.7.1構(gòu)建枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點-通路網(wǎng)絡，見圖5。通過CytoScape3.7.1內(nèi)置的NetworkAnalyzer分析枳術(shù)丸治療血脂異常網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點。

圖3 枳術(shù)丸-血脂異常靶點PPI網(wǎng)絡中的module

圖4 枳術(shù)丸主要成分潛在靶點的富集分析

Cytoscape網(wǎng)絡分析表明，槲皮素連接度（Degree）為46，介度（BetweennessCentrality）為0.4343，緊密度（ClosenessCentrality）為0.5879，預測槲皮素為枳術(shù)丸治療血脂異常的主要成分，其次為山柰酚（連接度為21，介度為0.0690，緊密度為0.4512）、木犀草素（連接度為20，介度為0.0792，緊密度為0.4470）柚皮素（連接度為16，介度為0.1040，緊密度為0.4311），見表4。

ESR1在網(wǎng)絡中的連接度為35，介度為0.1688，緊密度為0.6101，預測ESR1為枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的最主要靶點。PPARG、NOS2、ESR2、PTGS2、PTGS1、MAPK14、ACHE、ADRB2、F7亦為相對重要的靶點，見表3。

2.6 分子對接驗證

分子對接網(wǎng)站SystemsDock可在復雜網(wǎng)絡基礎上，通過對接模擬和分子通路圖分析配體選擇性和配體動作，進而根據(jù)其綜合特征以評估蛋白質(zhì)?配體結(jié)合潛能。分子對接所得結(jié)果示Docking Score≥7的有12種（8.6%），介于5-7的有77種（55%），介于4.25-5的有30種（21.4%），小于4.25的有21種（15%），其中枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的主要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等與4個靶點的結(jié)合活性均較強。Docking Score大于4.25時表示活性成分與靶點間存在結(jié)合能力，大于5.0時表示結(jié)合活性較佳，大于7.0時表示結(jié)合活性極佳[13]，結(jié)果表示評分大于4.25者占總數(shù)85%，大于5的占63.6%即大部分靶點與成分的結(jié)合活性較好，分子對接結(jié)果見圖6。

表3 枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常靶點通路富集結(jié)果

圖5 枳術(shù)丸成分-血脂異常靶點-通路網(wǎng)絡圖

表4 枳術(shù)丸主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

表5 枳術(shù)丸主要活性成分靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

3 討論

血脂異常是較為常見的代謝性疾病，亦是目前公認的動脈粥樣硬化的高危因素。中藥復方調(diào)治血脂異常的療效不劣于甚至優(yōu)于臨床一線西藥對照，尤其是在改善癥狀方面擁有極大潛力。吳立華[14]等通過臨床試驗證明對于原發(fā)性高血脂癥患者，服用氟伐他汀加枳實膠囊比單純服用氟伐他汀療效顯著，萬勇等[15]通過隨機雙盲對照研究證實荷葉降脂顆?？山档透视腿?，尤其在改善臨床癥狀方面效果較佳。喬羽等[16]通過對中藥荷葉制劑干預脂代謝的有效性進行Meta分析和對安全性進行評價，結(jié)果顯示在血脂干預常規(guī)治療基礎上，聯(lián)合使用中藥荷葉相關制劑可有一定的調(diào)脂減肥效應，且安全性良好。動物試驗亦表明枳實[17]可降低高血脂模型SD大鼠血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。白術(shù)精提物能有效調(diào)節(jié)高脂大鼠血脂紊亂，尤其對升高HDL-C有顯著療效[18]，中、高劑量荷葉水提物均可使脂肪細胞leptin蛋白表達下調(diào)和leptin的mRNA水平下降[19]。

在血脂異常的臨床研究中，吳海芳等通過多中心收集1019例血脂異常患者病例資料，認為血脂異常的核心臟腑病位在脾，病性實則以血瘀、痰濁為主,虛則以氣虛、脾虛為主[20]。尹湘君等通過分析1975年至2015年CNKI發(fā)表的文獻,發(fā)現(xiàn)近10年血脂異常證候要素靶位以脾為多，病因以氣虛為主[21]。根據(jù)對中醫(yī)經(jīng)典理論的探討并結(jié)合臨床經(jīng)驗，本課題組認為血脂異常的主要病機為“脾失運化，濁滯血脈”，病位在脾[22]，采用運脾化濁法治療血脂異常，可以使患者“脾主運化，主轉(zhuǎn)樞”功能恢復，血脈中濁邪消除，從而取得良好的臨床療效。枳術(shù)丸出自李東垣所著《脾胃論》，為健脾消積之經(jīng)典名方。方中白術(shù)補脾家之元氣，枳實行氣消積、化痰除痞，荷葉升發(fā)清陽，三藥相伍，健運脾氣，消補兼施，祛濁升清，契合運脾化濁之法。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法初步篩選出枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等。血脂調(diào)節(jié)機制的相關基礎研究表明，槲皮素能以濃度依賴的方式顯著增強巨噬細胞中膽固醇外流與ABCA1 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達[23]，并且可能通過SCAP-SREBP2-LDLr信號通路改善脂質(zhì)代謝[24]。山柰酚可增強脂肪分解并對抗高脂肪酸及受損葡萄糖的攝取、糖原合成、AMPK活性以及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）的表達[25]，木犀草素能借助AMP活化蛋白激酶（AMPK）-Sirtuin（SIRT）1信號傳導降低THP-1細胞衍生的巨噬細胞中總膽固醇水平，同時抑制巨噬細胞趨化因子和炎性細胞因子表達[26]，柚皮素可抑制脂肪生成并降低脂肪細胞中胰島素敏感性和脂聯(lián)素的表達[27]。分子對接驗證結(jié)果亦表明，槲皮素、山柰酚、木犀草素及柚皮素與主要靶點（ESR1，ESR2，NOS2，PPARG）的結(jié)合活性較強，因此枳術(shù)丸可能主要通過槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等調(diào)治血脂異常。

圖6 分子對接結(jié)果

本研究結(jié)果表明，枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的靶點主要集中在ESR1，而PPARG亦為重要靶點之一。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是調(diào)節(jié)脂肪組織中血管生成的關鍵因子，而ESR1基因敲除的雌性小鼠腹股溝和性腺白色脂肪組織中VEGFA表達較低[28]，這是ESR1在調(diào)節(jié)脂肪組織VEGFA中的重要作用的證據(jù)之一，而核激素受體PPARγ（PPARG）促進脂肪生成和巨噬細胞分化，是脂肪形成的關鍵調(diào)節(jié)因子，是主調(diào)節(jié)器[29]。枳術(shù)丸調(diào)治血脂異常的通路主要有AGERAGE信號通路（hsa04933）、HIF-1信號通路（hsa04066）以及脂肪細胞中脂肪分解的通路（hsa04923）。高脂肪、高糖飲食以及食用油炸、烤制食物會增強AGEs的產(chǎn)生和積累[30]。apo-脂蛋白B（apo-B）是LDL大分子的表面蛋白，apo-B的糖化反應可影響脂肪的生成。糖化應激通過AGEs與RAGE的結(jié)合誘導炎癥和氧化應激。有學者發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE可介導高膽固醇血癥引起的動脈粥樣硬化等多種病變，并且sRAGE水平與HDL呈正相關[31]，而HIF-1信號通路可通過抑制長鏈?；o酶A脫氫酶與中鏈?；o酶A脫氫酶抑制脂肪酸的分解代謝，從而導致活性氧的減少和脂肪積累[32]。故推測枳術(shù)丸可能通過抑制HIF-1信號通路從而降低脂肪的產(chǎn)生。

研究結(jié)果表明枳術(shù)丸的同一化合物可調(diào)控不同靶點，而同一靶點可干預不同的生物學過程及信號通路，體現(xiàn)了枳術(shù)丸多通路、多靶點聯(lián)合作用的特點。這提示通過調(diào)控網(wǎng)絡中的單個或多個重要靶點即可對整個網(wǎng)絡進行調(diào)節(jié)，為臨床運用枳術(shù)丸治療血脂異常提供了科學依據(jù)，為后續(xù)審定枳術(shù)丸臨床療效評價指標提示了標的，也為發(fā)掘枳術(shù)丸的潛在作用機制提供了新的方向。但限于網(wǎng)絡藥理學方法論的局限性以及中藥組分在煎煮時發(fā)生化學反應的復雜性，本研究未將枳術(shù)丸煎煮后的化學成分以及枳術(shù)丸活性成分在體內(nèi)的代謝物納入分析。本研究主要是以生物信息學與海量數(shù)據(jù)計算的結(jié)果為基礎，后續(xù)將在此基礎進一步篩選與動物或細胞實驗驗證，進而明晰枳術(shù)丸的主要調(diào)控靶點。