基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討失笑散治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)的作用機制研究＊

伍娟娟，何 嘉，鄧海婷，劉秀芳，劉 銳

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西壯族自治區(qū)南寧市530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西壯族自治區(qū)南寧市530001）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜以外部位生長引起的一種疾病，本病最典型的癥狀是繼發(fā)性、進行性加劇的痛經(jīng)。EM的病理特征包括種植、侵襲及復(fù)發(fā)率高等[1-2]。中醫(yī)定義為“痛經(jīng)”、“癥瘕”等，病機主要為瘀血阻滯胞脈、子宮[3-4]，治法當(dāng)以活血化瘀為主[5]。在中醫(yī)婦科中講，瘀血內(nèi)阻，氣機不暢，不通則痛易致痛經(jīng)。中醫(yī)經(jīng)典名方失笑散始載于《太平惠民和劑局方》是由蒲黃、五靈脂所組成，所言“治產(chǎn)后心腹痛欲死，百藥不效，服此頓愈”，其藥甚佳，具有活血化瘀、散結(jié)止痛之功效，主治瘀血內(nèi)停、脈道阻滯、血行不暢所致不通之痛。

失笑散化學(xué)成分復(fù)雜，已有藥理研究證實失笑散在不同疾病中具有不同的作用，包括調(diào)節(jié)雌、孕激素水平,抑制異位組織瘢痕增生,抗血管生成和抗炎和改變血液流變學(xué)[6-10]等。同時，失笑散也參與了多個疾病的病理生理過程[11-13]，以上兩個方面都是其“異病同治”的基礎(chǔ)，但其對異位內(nèi)膜侵襲轉(zhuǎn)移引起疼痛的潛在機制仍不清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了多向藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的理念，構(gòu)建失笑散與EM相互作用的藥物與多層次網(wǎng)絡(luò)分析藥效活性成分和可能的分子網(wǎng)絡(luò)機制,從而建立中藥及其復(fù)方協(xié)同作用聯(lián)系[14-15]，旨在為揭示失笑散作用機制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 失笑散化學(xué)成分信息的收集

通過TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）收集到失笑散中藥蒲黃的化學(xué)成分進行活性篩選，該數(shù)據(jù)庫共收集了《中華人民共和國藥典》記載的499味中藥材，包含了12144種化學(xué)成分。另外，依據(jù)藥物ADME（吸收、分布、代謝及排泄）特性。選取同時滿足閾值OB≥30%和DL≥0.18的成分作為潛在的活性成分，同時通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫查找五靈脂的化學(xué)成分進行活性篩選，該數(shù)據(jù)庫通過相似產(chǎn)物靶點相近的原理，用留—法互作交叉驗證進行了預(yù)測的驗證，用已驗證過的化合物與蛋白的互作作為金標(biāo)準(zhǔn)，來對互作進行驗證。并通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以及查閱文獻獲得這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并保存為Smiles格式。

1.2 靶點的選擇

將篩選得到的潛在活性分子的Smiles結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget-prediction.ch/）數(shù)據(jù)庫。在靶點預(yù)測中，3D相似性閾值設(shè)置為0.75，2D相似性閾值設(shè)置為0.45，由此獲得與活性成分最相關(guān)的靶點信息。挖掘失笑散中的成分、及對應(yīng)的潛在靶點，并用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。利用Gene Cards（http://www.genecards.org/）和DisGeNET（http://www.disgenet.org/）搜索關(guān)鍵詞子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis）和痛經(jīng)（dysmenorrhea），合并2個數(shù)據(jù)庫，去除重復(fù)和假陽性的基因，最后與活性成分相關(guān)的靶點相映射，獲得失笑散活性成分的潛在作用靶點。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選

根據(jù)以上預(yù)測結(jié)果，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）是系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)重要研究內(nèi)容，蛋白相互作用是細胞、組織的功能的基礎(chǔ)，在機體的生理和病理上起到重要的作用。相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）用來分析已知和預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫。將失笑散活性成分作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為人類，獲得蛋白互作關(guān)系，并將該文件中node 1、node 2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并得到網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。利用“Network Analyzer”模塊分析PPI網(wǎng)絡(luò)的拓撲屬性參數(shù)，選取度（degree）和介度中心度（betweenness）同時在平均數(shù)之上的靶標(biāo)為“關(guān)鍵靶標(biāo)”，研究關(guān)鍵靶標(biāo)可能的藥理作用。因其兩個為主要拓撲參數(shù)。

1.4 靶點生物功能注釋分析

DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）是高通量的生物數(shù)據(jù)功能分析挖掘工具，將獲得的失笑散化合物潛在作用靶點導(dǎo)入功能注釋工具，限定研究物種為人類，選擇Gene Ontology下的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）3個部分分 析，選 擇Pathway分析中KEGG Pathway，設(shè)定Bonferroni校 正P<0.01，經(jīng)Kappa算法進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與體內(nèi)通路。

2 結(jié)果

2.1 失笑散活性化合物的篩選

通過數(shù)據(jù)庫檢索及文獻整理，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，通過OB、DL指標(biāo)進一步篩選，共收集失笑散的化學(xué)成分15個，其中蒲黃8個，五靈脂7個，見表1。

2.2 失笑散化合物—靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

將潛在活性成分的Smiles格式上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，得到所有成分的預(yù)測靶點225個。其中，失笑散15個化學(xué)成分對應(yīng)225個潛在靶點，五靈脂的潛在作用靶點有105個、蒲黃120個，利用Cytoscape3.2.1軟件將225個化合物與靶點。構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。見圖1，在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點的表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連路線的條數(shù)。該網(wǎng)絡(luò)中，每個化合物的平均靶點數(shù)目為15個，每個靶點平均與14.2個化合物相互作用。在靶點中，度值最高的前3位是VEGFA（人血管內(nèi)皮生長因子A）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和細胞間粘附分子-1（ICAM-1）。這體現(xiàn)了失笑散多成分與多靶點之間共同作用的機制，符合中藥復(fù)方的特點。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶標(biāo)分析

將上述作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，利用Cytoscape軟件繪制蛋白關(guān)系，分別構(gòu)建化合物潛在靶點PPI（158個節(jié)點，620條邊）和子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)靶點PPI（570個節(jié)點，11913條邊），見圖2，靶點以圓形節(jié)點表示，顏色越深、節(jié)點越大表示degree（代表網(wǎng)絡(luò)中具有相互作用的蛋白數(shù)目）越高。將以上兩個PPI網(wǎng)絡(luò)相交，對網(wǎng)絡(luò)中所有點的拓撲參數(shù)進行分析，選擇靶點中每個靶點的度拓撲參數(shù)值大于中位數(shù)，即度≥16作為篩選核心靶點的條件，介度中心度大于中位數(shù)，即1.12×10-2得到41個核心靶點的失笑散與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)靶點網(wǎng)絡(luò)圖。其中涉及的41個核心靶點見表2。

表1 失笑散中15個候選化合物基本信息列表Table 1 Basic information of 15 candidate compounds of Shixiao Powder

圖1 失笑散主要成分—靶點網(wǎng)絡(luò)

圖2 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

2.4 關(guān)鍵靶點的通路富集分析

利用DAVID平臺對失笑散PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的41個核心靶點進行GO功能富集分析。根據(jù)設(shè)定Bonferroni校正P<0.01，經(jīng)Kappa算法進一步確定了41個GO條目（見表3），其中生物過程主要涉及高分子生物合成過程的正向調(diào)控、生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、高分子代謝過程的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與DNA依賴等方面；分子功能主要涉及生長因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等方面；細胞組成主要涉及細胞外組分、細胞外間隙等方面。表明失笑散的有效成分可能通過作用于這些信號通路來達到調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)治療疾病目的。在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得與關(guān)鍵靶點相關(guān)通路82條，結(jié)果表明失笑散可能主要通過癌癥通路（19個靶點）、子宮內(nèi)膜癌（7個靶點）（見圖4）、粘著斑（10個靶點）、絲裂原活化蛋白激酶（11個靶點）、細胞凋亡（7個靶點）NOD樣受體（10個靶點）、T細胞受體信號通路（12個靶點）等信號通路（見圖3），表明失笑散的活性成分靶點分布于不同的通路，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，強調(diào)從“單靶標(biāo)”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”研究模式的轉(zhuǎn)變，因此，它與中醫(yī)藥的有機結(jié)合是一個富有原創(chuàng)性的研究方向[16]。目前，運用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法來闡釋中藥多組分在分子水平的協(xié)同作用，再結(jié)合整體水平中藥作用機制的研究，能夠幫助更精確地揭示中藥的藥理學(xué)機制[17]。

表2 拓撲分析41個核心靶心信息

表3 失笑散治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)關(guān)鍵靶標(biāo)具有的功能信息

圖3 KEGG信號通路分析

圖4 子宮內(nèi)膜癌信號通路

失笑散中蒲黃、五靈脂兩位藥具有活血通絡(luò)，化瘀止痛的功效，在婦科臨床疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。陳靜麗等[18]臨床發(fā)現(xiàn)通過治療實性輕、中度痛經(jīng)的臨床療效，經(jīng)前3 d～5 d至經(jīng)凈給予治療有效率達到96.67%。王妍等[19]通過120例觀察治療前后痛經(jīng)程度及持續(xù)時間的變化，發(fā)現(xiàn)治療子宮腺肌病痛經(jīng)療效確切。在實驗研究表明[20]失笑散能夠明顯增強離體子宮的收縮頻率，降低全血比黏度，抗血栓形成及鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。劉文粢等發(fā)現(xiàn)[21]失笑散中的Fe、Zn、Mn、Cu、Ni等微量元素具有活血的作用，其中Fe和Cu活血化瘀的作用較大。目前，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為蒲黃、五靈脂具有改善子宮微循環(huán)，鎮(zhèn)痛，降低毛細血管通透性，減少滲出，影響異位增生的子宮內(nèi)膜的局部代謝，促使異位內(nèi)膜退化脫落等作用。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)的作用機制做進一步深入研究。

本研究系統(tǒng)分析了蒲黃、五靈脂兩位中藥的有效成分，分析化合物與靶點的相互作用關(guān)系。其中化合物—靶點網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵藥物是山奈酚、槲皮素等，其是蒲黃中的有效成分。根據(jù)研究顯示[22]，槲皮素具有同步抑制卵巢癌細胞生存能力和免疫抑制因子VEGF表達,并且可以誘導(dǎo)細胞凋亡,這其中的機制與Wnt/βcatenin信號通路下調(diào)有關(guān)。在抗腫瘤方面[23]，通過抑制Eca109細胞的遷移、侵襲及血管新生；可抑制細胞增殖，調(diào)控細胞的附著和侵襲的作用。抑制體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（EVC304）生長[24]；還有減少毛細血管脆性、擴張冠狀動脈和增加冠脈血流量等作用。山柰酚是一種具有抗炎并且抗氧化作用的黃酮類化合物；周瑤等[25]研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用明顯，高劑量會降低晚期大腸腺瘤的復(fù)發(fā)，并從體外發(fā)現(xiàn)其對小鼠黑色素瘤細胞B16具有增殖抑制作用；還能通過抑制銅離子誘導(dǎo)成為氧化低密度脂蛋白，阻止對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取，有效預(yù)防動脈粥樣硬化。五靈脂酸[26-27]在體外有明顯的抑制血小板聚集活性，并顯示了不同程度的抗菌活性。

在化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中，部分關(guān)鍵化合物分子具有高度的中心性并且應(yīng)用于婦科領(lǐng)域的研究，雌激素受體（ESR1）、VEGFA（人血管內(nèi)皮生長因子A）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和細胞間粘附分子-1（ICAM-1）等為關(guān)鍵靶點。VEGFA主要作用是增加小靜脈血管與微血管的通透性，因此稱為血管通透因子，也稱促血管素。臨床研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA在子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹膜液中一直被高濃度檢測到，其水平似乎與疾病分期有關(guān)[28]。VEGFA在腹膜內(nèi)植入物的腺體區(qū)室中大量表達，在子宮內(nèi)膜瘤中，并且由活化的腹膜巨噬細胞分泌[29-30]。并且它的的表達表現(xiàn)出與卵巢類固醇調(diào)節(jié)一致的循環(huán)相依賴性。MMP和它們的抑制劑（TIMP）參與細胞外基質(zhì)重塑和環(huán)狀子宮內(nèi)膜周轉(zhuǎn)和月經(jīng)[31-32]。MMP的月經(jīng)周期階段特異性表達提示卵巢類固醇調(diào)節(jié)。MMP和TIMP之間的平衡對于維持適當(dāng)?shù)腗MP活性水平至關(guān)重要，并且不能維持這種平衡可能導(dǎo)致基質(zhì)分解和細胞侵襲。ICAM-1通過從子宮內(nèi)膜異位癥的潛在機制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的組成通過脫落這些細胞逃避自然殺傷細胞介導(dǎo)的清除[33-34]。受損的NK細胞功能可賦予回流的子宮內(nèi)膜細胞免疫特權(quán)狀態(tài)，從而易患疾病。子宮內(nèi)膜異位癥患者的巨噬細胞功能受損可能進一步導(dǎo)致這種細胞類型的病變清除率降低。MAPK1和MAPK3為主要核心靶點，都同屬于MAPK激酶家族，是由多種磷酸基團蛋白構(gòu)成，可觸發(fā)一系列的下游信號反應(yīng)，如參與基因表達、細胞存活和凋亡等多種生理過程。而且MAPK途徑的作用與癌癥、自身免疫性疾病等多種疾病相關(guān)[35]。Li等[36]研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥患者與對照組的基因差異表達譜中，細胞增殖誘導(dǎo)異位，說明在子宮內(nèi)膜異位癥中同樣涉及到MAPK信號通路。加壓素(AVP)作為核心靶點，也是五靈脂化合物Urea的靶點，研究發(fā)現(xiàn)AVP與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)密切相關(guān)，相對于粗大的血管,子宮肌層小血管對血管AVP的敏感性更大。Williams等[37]研究證實血管加壓素是一種比催產(chǎn)素更強烈的子宮收縮劑，對非孕子宮有較強的刺激作用，尤其在孕激素效應(yīng)與雌激素受體（ESR1）存在時作用明顯。

對失笑散的靶點進行PPI映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)了多個與多種復(fù)雜疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點，如TP53、IGF1、TNF、PIK3CA、CYP1A1、IL6、FOS、IL8、MAPK1、MAPK3、ESR1、PTGS2、EGFR等，本病多見瘀血內(nèi)阻，氣機不暢病機，治法常以活血化瘀為主，與活血化瘀功效相關(guān)的靶點包括ICAM1、MMP-9、TIMP-1和VEGFA[38-39]。為了說明作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。發(fā)現(xiàn)失笑散主要能夠調(diào)節(jié)高分子生物合成過程的正向調(diào)控、生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、高分子代謝過程的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與DNA依賴等方面功能。大多數(shù)的基因富集到了與癌癥有直接關(guān)系的通路上，包括癌癥通路、子宮內(nèi)膜癌通路、胰腺癌通路等；另一大部分主要調(diào)控信號通路，包括MAPK信號通路、T細胞受體信號通路、細胞凋亡等。Yotova等研究表明[40]MAPK信號傳導(dǎo)通路作為交匯點和關(guān)鍵通路，可被多種細胞外刺激通路激活進而參與胞內(nèi)信息的傳遞途徑。Wu等實驗發(fā)現(xiàn)雌激素能激活MAPK信號通路，子宮內(nèi)膜異位癥病灶中存在MAPK的高表達，給予鞘內(nèi)注射抑制劑后可使子宮內(nèi)膜異位癥病灶縮小、神經(jīng)纖維分布以及疼痛消失[41]。已有研究顯示[42]，失笑散通過降低丙二醇含量和提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-過氧化物酶活性，調(diào)控氧化損傷機制保護血管內(nèi)皮細胞，保護血管內(nèi)皮細胞的有效提取物。另外，根據(jù)分析結(jié)果推斷失笑散中的活性成分可能通過作用于與癌癥直接相關(guān)的通路，從而對多種癌癥起到治療作用。失效散治療腫瘤和心血管病的機理，可能也存在于治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)中，因為子宮內(nèi)膜異位癥是具有種植、浸潤、廣泛轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤特性的良性疾病，目前相關(guān)機制研究稀少，借此分析希望能進行初步探討。

綜上所述，本研究初步探究了失笑散多成分、靶點和通路的多因素機制過程，為后續(xù)從失笑散中提取有效藥物成分治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)提供了前提和依據(jù)。