基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索中藥治療代謝綜合征的活性成分及作用機(jī)制＊

劉艷飛，孫明月，姚賀之，柴露露，高 蕊＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院臨床藥理研究所 北京100091）

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）是以肥胖（或超重）、高血糖、高血壓、血脂代謝異常等為主要特征的一組臨床綜合征[1]。近年來(lái)我國(guó)MS的發(fā)病率明顯增高，數(shù)據(jù)顯示我國(guó)18歲以上的成人中MS的患病率約為33.9%，據(jù)此估計(jì)中國(guó)目前有4.5億MS患者[2]。MS嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，其心血管事件的發(fā)病及死亡危險(xiǎn)約為非MS患者的2-3倍[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)采取單一疾病的治療模式對(duì)MS的各個(gè)組分進(jìn)行不同方式的干預(yù)，尚缺乏整體干預(yù)方案。中醫(yī)藥治療MS具有很大的優(yōu)勢(shì)，前期課題組采用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)的研究方法，對(duì)治療代謝綜合征的中藥使用頻次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選取頻次居于前10的高頻中藥行進(jìn)一步的研究，十味高頻中藥分別為黃芪、茯苓、丹參、澤瀉、山楂、半夏、大黃、白術(shù)、黃連、川芎[4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索高頻中藥治療MS的主要活性成分、核心靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療MS提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 MS相關(guān)疾病靶點(diǎn)、基因的查詢

以"Metabolic Syndrome"為關(guān)鍵詞檢索TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、Pharmgkb（https://www.pharmgkb.org/）、CTD（http://ctdbase.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，去重后獲得疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶點(diǎn)蛋白的基因名稱(chēng)。

1.2 高頻中藥活性成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究以治療MS的高頻中藥黃芪、茯苓、丹參、澤瀉、山楂、半夏、大黃、白術(shù)、黃連、川芎為關(guān)鍵詞，分別檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[5]，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，對(duì)其成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選構(gòu)建。

1.3 MS靶點(diǎn)-高頻中藥成分相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將MS相關(guān)疾病靶點(diǎn)與中藥成分作用靶點(diǎn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的Gene name進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。將高頻中藥成分、高頻中藥成分作用的疾病靶點(diǎn)與MS的疾病靶點(diǎn)運(yùn)用Excel表格建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行整合，獲得高頻中藥成分作用于MS的靶點(diǎn)。采用Cytoscape軟件構(gòu)建MS靶點(diǎn)-高頻中藥成分網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化分析等。采用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件導(dǎo)出MS靶點(diǎn)-高頻中藥活性成分網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋽?shù)據(jù)，計(jì)算數(shù)據(jù)中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度（degree）和介數(shù)（betweenness）的中位數(shù)。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度（degree）和介數(shù)（betweenness）是網(wǎng)絡(luò)藥理分析中的重要參數(shù)，定義大于等于degree值中位數(shù)的2倍且具有較高介數(shù)（大于等于介數(shù)值的中位數(shù)）的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)[6]。得到MS核心靶點(diǎn)后，進(jìn)一步構(gòu)建中藥治療MS核心靶點(diǎn)-高頻中藥成分網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)核心靶點(diǎn)進(jìn)行中藥治療MS主要活性成分的篩選。

1.4 富集通路分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)行KEGG通路富集，Bonferroni法校正后P<0.05的通路被認(rèn)為是顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 MS疾病靶點(diǎn)篩選

檢索TTD、DrugBank、Pharmgkb、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得161個(gè)MS的疾病靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 高頻中藥的活性成分及其作用疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到十味高頻中藥已報(bào)道的成分732個(gè)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為條件，經(jīng)篩選后共得到活性成分黃芪20個(gè)、茯苓15個(gè)、丹參65個(gè)、澤瀉10個(gè)、山楂6個(gè)、半夏13個(gè)、大黃16個(gè)、白術(shù)7個(gè)、黃連10個(gè)、川芎7個(gè)，同時(shí)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索中藥成分作用的疾病靶蛋白，將中藥活性成分作用的疾病靶點(diǎn)與MS的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合，獲得中藥成分作用于MS靶點(diǎn)的608條結(jié)果。十味高頻中藥成分作用于MS的靶點(diǎn)基因的部分結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 MS靶點(diǎn)-高頻中藥成分相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape軟件建立“MS靶點(diǎn)—中藥成分網(wǎng)絡(luò)”，詳見(jiàn)圖1，該網(wǎng)絡(luò)有155個(gè)節(jié)點(diǎn)，612種相互作用關(guān)系。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)高頻中藥成分可作用于24個(gè)MS靶點(diǎn)，利用cytoscape3.6.0軟件分析計(jì)算MS靶點(diǎn)—中藥成分網(wǎng)絡(luò)的度（degree）值和介數(shù)，截取24個(gè)MS靶點(diǎn)的degree值中位數(shù)兩倍及其以上的節(jié)點(diǎn)（degree≥10）且具有較高介數(shù)（介數(shù)值≥8.47）的靶點(diǎn)為核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)，分析獲得了7個(gè)中醫(yī)治療MS的核心靶點(diǎn)，具體結(jié)果見(jiàn)表3，推測(cè)這7個(gè)靶點(diǎn)可能與高頻中藥治療MS的作用機(jī)制相關(guān)。

根據(jù)核心網(wǎng)絡(luò)的篩選，發(fā)現(xiàn)有137個(gè)中藥成分可以作用于7個(gè)MS核心靶點(diǎn)，為了進(jìn)一步分析網(wǎng)絡(luò)中主要的活性成分，針對(duì)137個(gè)成分及7個(gè)核心靶點(diǎn)構(gòu)建“中藥治療MS核心靶點(diǎn)-中藥成分網(wǎng)絡(luò)”（圖2），網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)有26個(gè)成分可以作用于4個(gè)及以上的靶點(diǎn)，且具有較高的介數(shù)（介數(shù)值≥4），分析網(wǎng)絡(luò)提示這些主要活性成分的變化可能對(duì)MS靶點(diǎn)-中藥成分網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生較大的影響，從而改變中藥治療MS的療效，推測(cè)這26個(gè)中藥成分為高頻中藥組治療MS的主要活性成分，具體中藥成分見(jiàn)表4。進(jìn)一步分析26個(gè)中藥活性成分中含有較多的黃酮類(lèi)化合物（山奈酚、槲皮素、兒茶素、異鼠李素等）、醌類(lèi)化合物（主要分為丹參酮；丹參內(nèi)脂類(lèi)，如四氫丹參酮、亞甲基丹參醌、二氫丹參內(nèi)脂、新隱丹參酮II等）。

將24個(gè)中藥成分作用于MS的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，排除寬泛的通路，選取Bonferroni法校正后P<0.05的通路，具體KEGG通路如表5所示。

3 討論

代謝綜合征是以肥胖（或超重）、高血糖、高血壓、血脂代謝異常等為主要特征的一組臨床綜合征[1]，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)中藥治療代謝綜合征的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。研究發(fā)現(xiàn)高頻中藥的主要活性成分黃酮類(lèi)和醌類(lèi)化合物可能作用于AR、PTGS2、PTGS1、ESR2、ADRB2、eNOS、PPARG等7個(gè)核心靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控上游通路胰島素抵抗通路，下游信號(hào)通路PPAR信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等達(dá)到治療代謝綜合征的作用。

表1 代謝綜合征疾病靶點(diǎn)

7 個(gè)信號(hào)通路中最多的作用為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。脂肪組織是機(jī)體內(nèi)重要的儲(chǔ)能器官，也為其他組織或器官提供能量[7],脂肪細(xì)胞的脂解過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由脂肪組織脂解產(chǎn)生的活性物質(zhì)與代謝性疾病如胰島素抵抗、糖尿病、脂肪肝、高血壓、心血管疾病密切相關(guān)[8,9]。

圖1 MS靶點(diǎn)—中藥成分網(wǎng)絡(luò)

表2 高頻中藥成分作用于MS的疾病靶點(diǎn)、基因的結(jié)果（部分）

核心靶點(diǎn)中PPARG、ESR能夠參與脂質(zhì)的代謝[10-14]。本研究中高頻中藥活性成分可作用于過(guò)氧化物酶γ受體（PPARG）、雌激素受體（ESR）等靶點(diǎn)，這一作用主要通過(guò)PPAR信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、花生四烯酸信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ的基因多態(tài)性與糖脂代謝有著一定的關(guān)系。唐新等[10]通過(guò)測(cè)定糖尿病患者與正常健康者PPARG基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)PPARG基因可能參與糖尿病患者的糖脂代謝。研究顯示PPAR與相關(guān)的配體結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控靶基因而調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪、能量的代謝[11,12]。高倩等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PPAR配敲除的ob/ob小鼠肥胖和脂肪肝明顯加重。Monjo等[14]研究表明雌激素受體介導(dǎo)，可影響脂肪分布的部位，通過(guò)上調(diào)不同受體的表達(dá)，促進(jìn)脂肪的分解。雌激素信號(hào)通路通過(guò)細(xì)胞膜上的雌激素受體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)肽的水平達(dá)到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、影響能量代謝，同時(shí)可促進(jìn)瘦素及其脂肪酸結(jié)合蛋白的分泌，促進(jìn)脂肪的分解[15]?；ㄉ南┧崾求w內(nèi)分布最為廣泛的多不飽和脂肪酸之一,對(duì)于維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的作用[16,17]，文獻(xiàn)表明花生四烯酸對(duì)胰島素抵抗及肝糖原輸出紊亂具有預(yù)防作用[18],可抑制前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化、減少脂肪生成量[19]。因此，高頻中藥可能通過(guò)PPAR信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、花生四烯酸信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞的脂解作用達(dá)到調(diào)節(jié)脂肪代謝，治療代謝綜合征中血脂異常這一組分。

表3 高頻中藥成分治療MS的核心靶點(diǎn)

圖2 中藥治療MS核心靶點(diǎn)-中藥成分網(wǎng)絡(luò)

已知eNOS、ADRB2是調(diào)節(jié)血管舒縮功能的介質(zhì)[20-25]，PTGS1、PTGS2具有抗血管收縮介質(zhì)的作用[28,29]。內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）可參與血壓的調(diào)節(jié)，有研究表明內(nèi)皮一氧化氮合酶位點(diǎn)基因突變與高血壓的發(fā)生有一定的關(guān)系[20]，內(nèi)皮一氧化氮合酶的含量與血清脂聯(lián)素、一氧化氮聯(lián)合作用影響著高血壓、糖尿病患者的血壓、血糖水平[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)阻斷大鼠腦內(nèi)eNOS的活性時(shí)，大鼠的平均動(dòng)脈壓會(huì)升高，在高血壓發(fā)病前期，大鼠腦內(nèi)的eNOS的活性降低，參與了高血壓的生成，在形成穩(wěn)定性高血壓時(shí)，eNOS的活性會(huì)出現(xiàn)升高以代償性地降低血壓，因此，eNOS在血壓變化的過(guò)程中起著重要的作用[24]。β2腎上腺素能受體是交感神經(jīng)的重要組成之一，若其功能障礙，可導(dǎo)致高血壓（主要為原發(fā)性高血壓）的發(fā)生，當(dāng)β2上腎上腺素能受體功能的基因表型（如Arg16Gly、Thr164Ile、Gln27Glu等）發(fā)生改變時(shí)，患者的血壓會(huì)發(fā)生明顯的變化[25-27]。前列腺素G/H合酶（PTGS）內(nèi)皮源性血管舒張因子可以前列環(huán)素受體G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合，激活G蛋白，引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，cAMP激活蛋白激酶A，引起血小板聚集性抑制，血管平滑肌松弛因此前列環(huán)素及其類(lèi)似物可產(chǎn)生對(duì)抗血管收縮介質(zhì)的作用，引起血壓的降低[28,29]。因此，高頻中藥可能作用于eNOS、ADRB2、PTGS1、PTGS2參與調(diào)節(jié)代謝綜合征患者的血壓水平。

表4 高頻中藥治療MS的主要活性成分

表5 KEGG通路富集結(jié)果

此外，肥胖、糖尿病、高脂血癥、高血壓等與代謝相關(guān)的疾病逐年增多，而胰島素抵抗是上述疾病共同的危險(xiǎn)因素及病理基礎(chǔ)，胰島素信號(hào)通路任何一位點(diǎn)的異常都可導(dǎo)致胰島素抵抗[30]。肥胖是發(fā)生在脂肪組織中的炎癥狀態(tài)，肥胖引起的胰島素抵抗可能與炎性細(xì)胞因子（如TNF-α）的表達(dá)增加有關(guān)[31]，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α處理脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出胰島素信號(hào)和糖攝取降低，TNF-α-/-小鼠高脂飲食誘導(dǎo)肥胖后與對(duì)照組相比，血糖和胰島素水平明顯降低，葡萄糖和胰島素敏感性得到改善[32]。雄激素受體介導(dǎo)雄激素發(fā)揮作用，雄激素的水平與肥胖、糖脂代謝相關(guān)。雄激素受體介導(dǎo)雄激素發(fā)揮作用，雄激素水平過(guò)高的女性，如多囊卵巢綜合征患者，可出現(xiàn)肥胖、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗以及糖尿病等肥胖相關(guān)疾病[33,34]。本研究發(fā)現(xiàn)高頻中藥可以作用于雄激素及胰島素抵抗信號(hào)通路達(dá)到減輕代謝綜合征患者肥胖及胰島素抵抗的問(wèn)題。

26 個(gè)中藥活性成分中含有較多的黃酮類(lèi)化合物（山奈酚、槲皮素、兒茶素等）、醌類(lèi)化合物（丹參酮、丹參內(nèi)脂類(lèi)等）。文獻(xiàn)研究顯示，黃酮類(lèi)化合物如兒茶素、槲皮素等均對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性脂質(zhì)代謝異常、動(dòng)脈粥樣硬化具有較好的防治作用[35-37]。于春剛等[38]建立鵪鶉高脂食餌性動(dòng)脈粥樣硬化模型后，將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、洛伐他汀組（79.5 mg·kg-1）及兒茶素低劑量組（20 mg·kg-1）、中劑量組（40 mg·kg-1）、高劑量組（80 mg·kg-1），結(jié)果顯示與模型組相比,兒茶素中劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇含量明顯升高，各劑量組肝臟脂肪變分級(jí)明顯低于模型組，研究表明兒茶素具有調(diào)節(jié)血脂和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用。呂麗等[39]將動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠分為空白對(duì)照組、辛伐他汀組（4 mg/kg/d）、槲皮素高劑量組（50 mg/kg/d）及低劑量組（25 mg/kg/d），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素可降低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂甘油三酯及總膽固醇水平，實(shí)現(xiàn)其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/NF-κb通路有關(guān)。醌類(lèi)化合物如丹參酮聯(lián)合西藥可明顯降低高血壓患者的血壓和血脂水平[40,41]。楊文聰?shù)萚40]將80例原發(fā)性高血壓患者隨機(jī)分為卡托普利對(duì)照組，丹參酮ⅡA聯(lián)合卡托普利的治療組，予以藥物治療8周后結(jié)果顯示兩組的血壓均有下降；與對(duì)照組相比，治療組患者的血壓水平明顯降低，血管內(nèi)皮一氧化氮含量明顯增加、內(nèi)皮素-1含量明顯降低，結(jié)果提示丹參酮ⅡA聯(lián)合卡托普利可以顯著降低原發(fā)性高血壓患者的血壓水平，其作用機(jī)制可能與調(diào)控血管內(nèi)皮功能有關(guān)。以上提示黃酮類(lèi)化合物和醌類(lèi)化合物具有抗代謝綜合征危險(xiǎn)組分的作用，其可能是治療MS的重要成分群組，在后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制的研究中可加以關(guān)注。

高頻中藥治療代謝綜合征呈現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，其主要活性成分可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝（如PPARG、ESR等）、調(diào)節(jié)血壓水平（如eNOS、ADRB2、PTGS1、PTGS2等）、減輕胰島素抵抗等作用參與對(duì)代謝綜合征不同危險(xiǎn)因素的調(diào)控，進(jìn)而影響代謝綜合征的發(fā)展。本研究為后續(xù)系統(tǒng)開(kāi)展中藥治療代謝綜合征的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。