基于系統(tǒng)藥理學(xué)的麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的作用機制研究＊

羅 蔚，鄭景輝＊＊，徐文華，伍新誠，李建橡

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧532200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧532200）

緩慢型心律失常（Bradycardia arrhythmia）又稱為心動過緩，是心血管疾病的常見病證之一，主要包括竇性心動過緩、病態(tài)竇房結(jié)綜合征、房室傳導(dǎo)阻滯等[1]。長期緩慢型心律失?？沙霈F(xiàn)心悸、心慌、胸悶、胸痛、乏力、暈厥等癥狀，甚至猝死。根據(jù)臨床癥狀，緩慢型心律失?？蓺w屬于中醫(yī)的“脈遲”、“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“厥證”等范疇[2]。麻黃細(xì)辛附子湯是《傷寒論》中治療太陽、少陰兩感證的高效名方，被廣泛運用于緩慢型心律失常的治療之中，并擁有良好的治療效果[3-4]。系統(tǒng)藥理學(xué)(Network pharmacology)作為以系統(tǒng)生物學(xué)理論為基礎(chǔ)、探尋藥物活性成分及靶點、對生物網(wǎng)絡(luò)進行分析的新興學(xué)科，強調(diào)通過信號通路的調(diào)節(jié)從而使藥物的藥效最大化[5-6]。本研究運用系統(tǒng)藥理學(xué)方法對麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的作用機制進行探究，以期為麻黃細(xì)辛附子湯藥理作用機制的研究提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺,http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)；TCMID數(shù)據(jù)庫（中藥信息綜合數(shù)據(jù)庫，http://www.megabionet.org/tcmid/）；Pharmmapper數(shù)據(jù)庫（藥效團匹配與潛在識別靶標(biāo)平臺,http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php）；OMIM數(shù)據(jù)庫（人類基因和遺傳數(shù)據(jù)庫，http://www.omim.org/）；CTD數(shù)據(jù)庫（比較毒物遺傳數(shù)據(jù)庫，http://ctd.mdibl.org,）；Genecards數(shù)據(jù)庫（人類基因綜合數(shù)據(jù)庫，http://www.genecards.org/）；DAVID數(shù)據(jù)庫（富集分析系統(tǒng)，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）；Draw Venn Diagram網(wǎng)站（韋恩圖繪制網(wǎng)站，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；String數(shù)據(jù)庫（蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫,https://string-db.org/cgi/input.pl）；KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)；Systemsdock數(shù)據(jù)庫（系統(tǒng)分子對接數(shù)據(jù)庫，http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）；PDB數(shù)據(jù)庫（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，https://www.rcsb.org/）；Cystoscope 3.6.1制圖軟件；Graphpad prism7.0繪圖軟件。

1.2 研究方法

1.2.1 麻黃細(xì)辛附子湯中藥物成分的收集與篩選

將麻黃細(xì)辛附子湯中藥物（麻黃、細(xì)辛、附子）名稱代入TCMSP數(shù)據(jù)庫及TCMID數(shù)據(jù)庫，收集藥物相對應(yīng)的化學(xué)成分。口服利用度（OB）和類藥性(DL)是決定藥物分子是否具有較好的口服生物利用度以及成藥性優(yōu)劣的關(guān)鍵參數(shù)[7]，參考相關(guān)文獻報道[8]后，本研究以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件對收集到的藥物化學(xué)成分進行二次篩選，得到相對高活性的化合物。

1.2.2 藥物成分靶點的預(yù)測

將1.2.1中篩選得出的化合物統(tǒng)一保存為MOL2格式文件，上傳至Pharmmapper平臺，并設(shè)置條件為“藥效團模型”，返回靶點數(shù)設(shè)置為TOP300，剔除非人源靶點，提交后由該平臺完成藥物成分靶點的預(yù)測，篩除重復(fù)部分后作為候選靶點[9]。

1.2.3 藥物成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

STRING數(shù)據(jù)庫作為一個儲存已知的和預(yù)測的蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，可對蛋白之間直接或間接的相互作用進行評價。本研究將1.2.2中所得的候選靶點信息上傳STRING10.5在線軟件，限定研究物種為“Homo sapiens”，獲得相應(yīng)人源蛋白。并將從STRING數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出的文件中node1、node2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，以探究麻黃細(xì)辛附子湯的藥理學(xué)作用機制，其中“節(jié)點”（node）表示分子、靶蛋白，“邊”（edge）表示成分與靶點之間的關(guān)系。

1.2.4 緩慢型心律失常相關(guān)靶點的獲取

本研究以緩慢型心律失常（Bradycardia arrhythmia）及心動過緩（Bradycardia）為關(guān)鍵詞，分別通過OMIM數(shù)據(jù)庫、CTD數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫來搜索疾病相關(guān)靶點，選取每個數(shù)據(jù)庫TOP400的靶點并篩除重復(fù)靶點。

1.2.5 麻黃細(xì)辛附子湯對緩慢型心律失常相關(guān)靶點的收集

將1.2.2中所獲得的藥物成分靶點與1.2.4中所收錄的疾病靶點輸入Draw Venn Diagram網(wǎng)站中以韋恩圖形式進行交集比對,獲取麻黃細(xì)辛附子湯作用于緩慢型心律失常的相關(guān)靶點。

1.2.6 靶點的富集分析

為了進一步闡明麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的作用機制，本研究采用DAVID數(shù)據(jù)庫對1.2.5中所獲交集靶點進行GO（Gene Ontology）富集分析，包括生物過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）分析，并采用KEGG數(shù)據(jù)庫進行生物通路分析，探尋麻黃細(xì)辛附子湯作用于緩慢型心律失常的關(guān)鍵調(diào)控通路。

1.2.7 網(wǎng)絡(luò)靶點特性分析

運用Cytoscape 3.6.1軟件中插件Network Analyzer計算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點之間如存在調(diào)控作用關(guān)系則以邊相連。本研究基于平均最短路徑、介數(shù)中心性、中心接近度、聚類系數(shù)、度值等參數(shù)評估節(jié)點在全網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵性。

1.2.8 成分-靶點分子對接

為檢測麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的作用靶點是否具有較好的結(jié)合活性，本研究采用Systemsdock數(shù)據(jù)庫進行成分-靶點分子對接。Systemsdock數(shù)據(jù)庫是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測和分析的系統(tǒng)分子對接服務(wù)器，它應(yīng)用高精度對接模擬和分子路徑圖來綜合表征配體選擇性[10]。首先登陸Systemsdock數(shù)據(jù)庫，將麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的潛在的14個作用靶點輸入PDB ID一欄，找活性位點，計算格點，調(diào)整X-Y-Z坐標(biāo)來細(xì)化位置。成功后開始對接，整理對接結(jié)果中的docking score并分析。

2 結(jié)果

2.1 麻黃細(xì)辛附子湯中的藥物成分及相應(yīng)靶點

以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件下，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫TCMSP數(shù)據(jù)庫及TCMID數(shù)據(jù)庫共收集到麻黃23個成分、細(xì)辛8個成分、附子21個成分（結(jié)果見表1），其中編號MOL000422的化學(xué)成分異塔拉定為麻黃與細(xì)辛重復(fù)成分，保留唯一值后得到51個滿足條件的藥物成分。將該51個成分提交至Pharmmapper平臺后獲得靶點共707個，篩除重復(fù)部分后剩余263個靶點。

表1 麻黃細(xì)辛附子湯中的51個活性化合物基本信息

2.2 藥物成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape3.6.1軟件將上述活性成分及預(yù)測靶點繪制出成分和作用靶點的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（如圖1），其中紅色節(jié)點表示化合物，黃色節(jié)點表示藥物靶點，每條邊則表示化合物分子與靶點之間的相互作用關(guān)系。通過網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建我們共獲得297個節(jié)點和982個關(guān)系。其中，木犀草素、去甲烏頭堿、兒茶酚、鯊烯等有效成分與網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點相互作用，而GPI、ETS1、UNC45A、MT-CYB等靶點亦能作用于多個有效成分。

圖1 麻黃細(xì)辛附子湯化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 緩慢型心律失常相關(guān)靶點

以緩慢型心律失常（Bradycardia arrhythmia）及心動過緩（Bradycardia）為關(guān)鍵詞，通過OMIM、CTD、Genecards數(shù)據(jù)庫搜索出疾病相關(guān)靶點數(shù)量31326個。根據(jù)相關(guān)度每個數(shù)據(jù)庫取前400個的靶點，去重復(fù)后保留566個緩慢型心律失常相關(guān)靶點。

2.4 麻黃細(xì)辛附子湯作用于緩慢型心律失常相關(guān)靶點的收集

將麻黃細(xì)辛附子湯中的成分靶點與緩慢型心律失常相關(guān)發(fā)病機制靶點進行交集比對，得出14個交集靶點（如圖2），即該方劑中明確作用于緩慢型心律失常的靶點，分別是GSR、RAC1、SOD2、SOD1、EMD、MTOR、ADRA1B、F2、PTGS2、SNTA1、ADRB2、S100A8、CALM2、ACHE。

圖2 麻黃細(xì)辛附子湯與緩慢型心律失常交集靶點韋恩圖

2.5 麻黃細(xì)辛附子湯對緩慢型心律失常作用靶點的富集分析

經(jīng)David數(shù)據(jù)庫GO分析，共得出個63個生物學(xué)過程，主要包括對活性氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的調(diào)控、谷胱甘肽代謝、應(yīng)激反應(yīng)、血壓調(diào)節(jié)、心肌收縮調(diào)節(jié)、心率調(diào)節(jié)、蛋白激酶活性調(diào)節(jié)、激活腎上腺素受體、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞對ATP的反應(yīng)、鋅離子反應(yīng)、超氧代謝過程、神經(jīng)元調(diào)控等（圖3列出排名前20的生物學(xué)過程）；細(xì)胞組成共10個，主要包括細(xì)胞外小體、溶酶體、質(zhì)膜、細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)等（見圖3）；分子功能共6項，包括：超氧化物歧化酶活性、硫酯酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、蛋白激酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、離子通道結(jié)合（見圖3）；KEGG分析后發(fā)現(xiàn)11條通路，其中P值小于0.05值的有5條（見表2），它們分別是：唾腺分泌、心肌細(xì)胞的腎上腺素能、cGMP-pkg信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路。

圖3 GO分析結(jié)果

2.5 麻黃細(xì)辛附子湯蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)分析

經(jīng)Network Analyzer分析，麻黃細(xì)辛附子湯的蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見表3，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)屬性發(fā)現(xiàn)，該PPI網(wǎng)絡(luò)中平均最短路徑在2.301～2.815，平均介數(shù)中心性在0.049～0.324，平均中心接近度0.3949，平均聚類系數(shù)為0.301，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度值曲線、介數(shù)中心性曲線接近于冪律分布這些蛋白也是該方發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，并在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)了較好的連通特性。

表2 麻黃細(xì)辛附子湯對緩慢型心律失常作用靶點的信號通路

表3 麻黃細(xì)辛附子湯蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析（按連通度排序取前十個）

2.5 麻黃細(xì)辛附子湯對緩慢型心律失常作用靶點分子對接結(jié)果

麻黃細(xì)辛附子湯對緩慢型心律失常的作用靶點分子對接結(jié)果如表4所示。一般認(rèn)為系統(tǒng)對接分值大于4.25表示對接分子與靶點之間有一定的結(jié)合活性，大于5.0表明對接分子與靶點之間有較好的結(jié)合活性，大于7.0則說明具有強烈的結(jié)合活性[11]。本次分子對接結(jié)果顯示：MTOR、SOD2、F2、SNTA1、CALM2、PTGS2、ADRB2、ACHEGSR、RAC1、EMD等11個作用靶點的系統(tǒng)對接分值均大于5.0，說明麻黃細(xì)辛附子湯與緩慢型心律失常預(yù)測的作用靶點有較好的結(jié)合活性。

表4 麻黃細(xì)辛附子湯對作用靶點分子對接結(jié)果

3 討論

緩慢性心律失常以心動過緩為特征,資料顯示,老年冠心病患者最易發(fā)生緩慢性心律失常,24小時動態(tài)心電圖檢出率高達75%[12]。隨著我國人口的老齡化,緩慢型心律失常的危害也將進一步加重。在緩慢性心律失常的治療方面，西醫(yī)以抗膽堿能藥物、異丙腎上腺素等藥物以及安裝起搏器為主要治療手段，但長期的藥物治療不良反應(yīng)較大，介入治療則費用昂貴，依從性相對較差[13]。而中醫(yī)藥在緩慢心律失常的治療上安全性較高，價格便宜，且療效良好，相對西醫(yī)更有優(yōu)勢[14-15]。麻黃細(xì)辛附子湯是《傷寒論》中治療太陽、少陰兩感證的高效名方，解表散寒的同時具有扶助陽氣、溫腎強心的功效，是治療緩慢型心律失常的常用方之一。系統(tǒng)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)理論為基礎(chǔ)、探尋藥物活性成分及靶點、對生物網(wǎng)絡(luò)進行分析，強調(diào)通過信號通路的調(diào)節(jié)從而使藥物的藥效最大化，這與中藥方劑多重靶點、多途徑和多成分的特點不謀而合，這也是系統(tǒng)藥理學(xué)尤為適用于中藥復(fù)方治療疾病的作用機制研究的原因。

為了探究麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的作用機制，本研究先利用TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺和PharmMapper數(shù)據(jù)庫研究了麻黃細(xì)辛附子湯3味中藥(麻黃、細(xì)辛、附子)的有效成分及其作用靶點，通過構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)分析了化合物與靶點直接的相互作用關(guān)系。結(jié)果顯示：木犀草素、去甲烏頭堿、兒茶酚、鯊烯等有效成分與多個靶點相互作用，說明它們是麻黃細(xì)辛附子湯中的多效活性化合物；GPI、ETS1、UNC45A、MT-CYB等靶點能作用于多個有效成分，是化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點。

這些成分靶點與通過基因數(shù)據(jù)庫確定下來的566個緩慢型心律失常相關(guān)疾病靶點共有14個交集靶點，可推斷這14個交集靶點是麻黃細(xì)辛附子湯作用于緩慢型心律失常的預(yù)測靶點。對預(yù)測靶點的GO功能分析結(jié)果顯示，麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的生物過程主要體現(xiàn)在對活性氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的調(diào)控、谷胱甘肽代謝、應(yīng)激反應(yīng)、血壓調(diào)節(jié)、心肌收縮調(diào)節(jié)等方面?；钚匝踉谥袠泻屯庵芏紝π难芟到y(tǒng)有重要的影響,中樞活性氧可介導(dǎo)交感興奮所致的心率、血壓等心血管效應(yīng)。于海云等人[16]在對活性氧對中樞心血管效應(yīng)的影響時發(fā)現(xiàn)：血清中活性氧含量的減少可以引起血壓的下降和心率的減緩。此外，有動物實驗研究表明，通過提高心肌組織勻漿中一氧化氮含量可以使實驗大鼠的心率,防止緩慢性心律失常進一步惡化[17]。谷胱甘肽代謝、應(yīng)激反應(yīng)、血壓調(diào)節(jié)、心肌收縮調(diào)節(jié)等也都與心率變異性密切相關(guān)[18-20]。細(xì)胞組成主要體現(xiàn)在細(xì)胞外小體、溶酶體、質(zhì)膜、細(xì)胞核等。有學(xué)者[21]曾提出，溶酶體通過對心肌及心肌細(xì)胞的電重構(gòu)產(chǎn)生影響，從而參與心律失常的發(fā)生、發(fā)展。Bkaily等[22]報道指出,細(xì)胞核及核上受體在心肌細(xì)胞電生理穩(wěn)態(tài)的維持及興奮-收縮偶聯(lián)過程中起重要作用,通過直接或間接地影響離子轉(zhuǎn)運，這也是心律失常的重要基礎(chǔ)。麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的分子功能則主要體現(xiàn)在超氧化物歧化酶活性、硫酯酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、蛋白激酶結(jié)合等。

在本次研究的KEGG生物途徑富集分析中，共得到5條P值小于0.05值的信號通路，分別為：唾腺分泌、心肌細(xì)胞的腎上腺素能、cGMP-pkg信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路。既往有研究表明，腎上腺素有興奮α受體、β受體的作用，從而發(fā)揮升高血壓、促進心肌收縮、加快心率、增強心室及房室傳導(dǎo)速度的作用[23-24]。廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶(PKG)是環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)最重要的下游靶點和主要依賴的蛋白酶之一，可松弛血管平滑肌、擴張血管、維持心律平穩(wěn)。Han等[25]通過實驗發(fā)現(xiàn)cGMP的含量的增加可而激活PKG,從而達到保護心肌細(xì)胞以及降低心律失常發(fā)病率的作用。Brunner等[26]在比較野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠eNOS的表達和鈣離子濃度的實驗中也發(fā)現(xiàn)cGMP含量的增加對心肌細(xì)胞具有保護作用。鈣離子在體內(nèi)有著重要作用,心律失常與心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有重要聯(lián)系，核受體通過心肌細(xì)胞內(nèi)離子通道及信號通路對胞內(nèi)鈣變化的影響是直接導(dǎo)致心律失常的重要原因之一。趙燦等［27］通過研究發(fā)現(xiàn)，心肌肌鈣蛋白在被cAMP活化的蛋白激酶作用下磷酸化,磷酸化后的肌鈣蛋白可與鈣離子結(jié)合,增加心肌收縮力。劉周英等人[28]通過對比實驗發(fā)現(xiàn),適當(dāng)降低心肌細(xì)胞上的鈣電流表達能有效治療心動過緩,并改善心肌細(xì)胞的功能。本次研究中麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常的KEGG分析結(jié)果亦包含有鈣信號通路，這說明：鈣信號具有成為緩慢型心律失常治療靶點的潛質(zhì)。此外，cAMP的活化蛋白激酶還能通過糖原分解的促進作用,增加心肌能量供應(yīng)從而增強心肌的收縮力，改善心動過緩。以上環(huán)節(jié)在本次研究中所得出的通路中均有反映，可以推測，麻黃細(xì)辛附子湯正是通過多種活效成分作用于這些顯著性富集的通路從而達到治療緩慢型心律失常的目的。值得注意的是，本次研究中所發(fā)現(xiàn)的麻黃細(xì)辛附子湯對唾腺分泌這一通路的調(diào)控作用在以往研究中尚未見報道，這值得我們在未來科研活動中繼續(xù)探入探究。

系統(tǒng)分子對接結(jié)果顯示，麻黃細(xì)辛附子湯對緩慢型心律失常作用靶點分子具有良好的結(jié)合活性，也說明麻黃細(xì)辛附子湯的活性成分可以與受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮作用。在11個結(jié)合活性良好的作用靶點里，MTOR的系統(tǒng)對接分值最高，即結(jié)合性最好。既往有研究表明，干預(yù)MTOR表達可以調(diào)控心肌細(xì)胞Bcl-2,Bax蛋白表達水平，從而減少心肌細(xì)胞凋亡,加強心肌收縮力、改善心功能[29]。此外，田振軍等人[30]通過實驗發(fā)現(xiàn)，激活MTOR信號通路可以促進心梗大鼠心肌細(xì)胞增殖、降低心肌纖維化面積和改善心功能中發(fā)揮重要作用。分子對接的結(jié)果也進一步為麻黃細(xì)辛附子湯治療緩慢型心律失常提供了新的思路。

綜上所述，本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)方法得出了麻黃細(xì)辛附子湯作用于緩慢型心律失?？赡艿臐撛诎悬c，探究了麻黃細(xì)辛附子湯在治療緩慢型心律失常中的作用機制，為進一步理解藥物有效成分-靶點-疾病相互作用機制提供了重要信息，也為中醫(yī)藥治療緩慢型心律失常的機制研究提供了新思路。