基于系統(tǒng)藥理學(xué)探究冠心Ⅱ號方治療冠心病的作用機制＊

楊文娜，徐文華，徐香梅，陳 旋，鄭景輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西 南寧530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530011）

近年來，冠心?。╟oronary heart disease，CHD）患病率和病死率逐年增高，據(jù)《中國心血管病報告2017（概要）》[1]顯示：我國心血管病防治工作已取得初步成效，但仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)?？傮w上看，中國心血管患病率及死亡率仍處于上升階段，推算心血管病現(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中冠心病有1100萬。冠心病是指冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，屬于中醫(yī)的“胸痹”、“心痛”、“真心痛”等范疇，中醫(yī)認為冠心病為“本虛標實”之證，五臟虛損是病之本，氣滯、血瘀、痰濁是病之標[2]。

冠心Ⅱ號方是由著名中醫(yī)臨床家郭士魁先生所創(chuàng)制的，方由丹參、赤芍、川芎、紅花和降香組成，具有活血化瘀的功效，臨床多用于治療冠心病心絞痛，現(xiàn)代藥理學(xué)證明冠心Ⅱ號方可抗血小板積聚、降低血脂、抗動脈粥樣硬化、增加冠脈血流量等[3]。但冠心Ⅱ號的藥理學(xué)研究大多仍停留在整體藥效研究的基礎(chǔ)上和動物指標上，傳統(tǒng)藥理學(xué)方法尚不能全面、深入闡釋冠心Ⅱ號方對冠心病的治療作用機制。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[4]、網(wǎng)絡(luò)靶標[5]、系統(tǒng)藥理學(xué)[6]等概念的提出與發(fā)展，這些新理念為中醫(yī)藥的研究帶來了新契機。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)的角度和分子的層面對中醫(yī)藥進行了系統(tǒng)的探索，將當前的“一靶一藥”模式的研究模式更新為新的“網(wǎng)絡(luò)靶多組分”模式[7]，系統(tǒng)藥理學(xué)是從系統(tǒng)水平上研究藥物與機體相互作用及其規(guī)律和作用機制的一門新興學(xué)科，即從分子、網(wǎng)絡(luò)、細胞、到組織、器官等不同水平上研究藥物治療疾病能變化機制，建立藥物對于機體的作用從微觀（分子、生化網(wǎng)絡(luò)水平）到宏觀（組織、器官、整體水平）的各水平間是相互關(guān)聯(lián)的學(xué)問[8]，其系統(tǒng)性、整體性的特點與中醫(yī)藥整體觀和辯證論治的原則相符合，為藥物復(fù)雜作用的研究提供了新思路、新方法和新技術(shù)。LI[9]等為探討參芪扶正注射液聯(lián)合多烯紫杉醇治療肺癌的機制，先通過網(wǎng)路藥理學(xué)方法預(yù)測出參芪扶正注射液和多烯紫杉醇的作用靶點，然后通過體內(nèi)和體外實驗方法驗證，實驗結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致，說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有一定的準確性。因此本研究利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法，探討冠心Ⅱ號方治療冠心病的作用機制，以期為深入開展冠心Ⅱ號方治療冠心病的基礎(chǔ)實驗研究提供參考和新思路。

1 數(shù)據(jù)庫與軟件

TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/），DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/），PharmMapper數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 2896160/），CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)，GeneGards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），string數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），David 6.8在線分析軟件（https://david.ncifcrf.gov/list.jsp），Cytoscape 3.6.1軟件，IGEMDOCK 2.1，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)。

2 方法

2.1 冠心Ⅱ號方有效活性化合物的篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺—TCMSP（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform)是個融合了藥物化學(xué)、藥代動力學(xué)、網(wǎng)絡(luò)靶點預(yù)測等網(wǎng)絡(luò)信息的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，該數(shù)據(jù)庫收錄了近500個已經(jīng)在中國藥典注冊過了的草藥，囊括了超過31 000種化學(xué)成分。TCMSP構(gòu)建的中藥化學(xué)分子庫較為全面，如在納入皂苷類中藥化合物時，還特意區(qū)分加入了皂苷去糖形式的化合物，使其中藥化學(xué)庫更加準確全面[10]。本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18為篩選條件，對冠心Ⅱ號方的五味藥丹參、赤芍、紅花、降香和川芎篩選出有效化合物，下載并保存為.mol2格式。

2.2 有效化合物的靶點預(yù)測

將2.1篩選出來的有效化合物，利用DrugBank數(shù)據(jù)庫和PharmMapper服務(wù)器對這些有效化學(xué)成分進行作用靶點預(yù)測?；赑harmMapper服務(wù)器反向藥效團匹配法，選擇藥效團模型，設(shè)定返回靶點數(shù)目為300，以.mol2格式上傳到PharmMapper服務(wù)器，得到冠心Ⅱ號方化合物潛在的靶點信息。

2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將冠心Ⅱ號方五味藥的化合物信息和化合物靶點信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表化合物、靶蛋白，邊代表活性成分-靶點的相互作用，并利用Cytoscape軟件中的Network Analyzer功能對化合物和靶點進行分析，Degree值越大，節(jié)點越大。

2.4 冠心病相關(guān)發(fā)病機制靶點的預(yù)測

利用GeneGards和CTD數(shù)據(jù)庫篩選出與冠心病相關(guān)的靶點，以“coronary heart disease”為檢索詞進行檢索，根據(jù)基因與疾病的相關(guān)度排序，各取前500個靶點，去掉重復(fù)的靶點，收集整合得到疾病靶點。

2.5 冠心Ⅱ號方對冠心病的潛在治療靶點的收集

將2.2得到的化合物靶點數(shù)據(jù)與2.4得到的冠心病相關(guān)發(fā)病機制靶點數(shù)據(jù)通過VENNY在線分析軟件進行比較，得到冠心Ⅱ號方對冠心病的潛在治療靶點。

2.6 潛在治療靶點的拓撲學(xué)分析和構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將潛在治療靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白相互作用，將結(jié)果保存為TSV格式文件，再將TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape軟件里進行可視化分析，在軟件中設(shè)置節(jié)點大小與顏色反映Degree大小變化，節(jié)點越大、顏色越深Degree越大，邊的粗細反映Combined score大小變化，Combined score值越大邊越粗，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.7 相關(guān)通路信息和注釋分析

將2.5得到的潛在治療靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，進行KEGG分析和GO分析，利用在線云平臺OmicShare網(wǎng)站將KEGG通路繪制成氣泡圖，用Graphpad Prism 7.0軟件繪制GO分析里的生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、細胞組成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。

2.8 活性成分與靶蛋白的分子對接

分子對接技術(shù)是基于配體與受體作用的鎖匙原理研究小分子配體與受體生物大分子的相互作用，能有效地確定與靶受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物[11]。從Uniprot數(shù)據(jù)庫中找到潛在靶點的蛋白信息，保存為pdb格式，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找靶蛋白對應(yīng)的活性成分，下載保存為.mol2格式，將靶蛋白數(shù)據(jù)信息和其對應(yīng)的活性成分信息導(dǎo)入IGEMDICK軟件進行分子對接，設(shè)置為默認參數(shù)：population size為200，Generation為70，number of solutions為2，Default Setting為Standart docking。

3 結(jié)果

3.1 冠心Ⅱ號方有效化合物的收集

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集到160個符合OB≥30%、DL≥0.18條件的化合物，其中丹參65個，赤芍29個，紅花22個，川芎7個，降香37個。去掉重復(fù)的化合物后共得到150個化合物。這150個化合物包括：芍藥苷（paeoniflorgenone）、甜菜堿（Sativanone）、黃檀苷（Dalbergin）、黃芩素（baicalein）等，各個化合物的OB和DL值見表1。

表1 冠心Ⅱ號方有效化合物表*

3.2 有效化合物的靶點預(yù)測

PharmMapper在線分析軟件是個通過反向藥效團匹配方法搜尋潛在藥物靶點,它能通過自動尋找與所查詢的分子結(jié)構(gòu)匹配最佳的藥效團,再根據(jù)匹配程度給與打分[12]。根據(jù)PharmMapper反饋的靶點，按匹配度從高到低，每個化合物取前十個靶點，PharmMapper沒有反饋回來的靶點從DrugBank數(shù)據(jù)庫里搜索補充。將收集到的所有靶點逐個輸入UniProt數(shù)據(jù)庫,利用UniProtKB再次確認靶點信息，限定物種為“Homo sapiens”，剔除掉非人源靶點和重復(fù)靶點，并校正為其官方名稱（official symbol），收集整合最后得到176個靶點。將化合物和靶點信息一同導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建“化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”，見圖1。由網(wǎng)絡(luò)圖可看出每一種化合物可有多個對應(yīng)靶點，每個靶點并不只對應(yīng)一種化合物，提示冠心Ⅱ號方具有多成分、多靶點的特點。

圖1 冠心Ⅱ號方化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 冠心病相關(guān)發(fā)病機制靶點的預(yù)測與潛在治療靶點的收集

利用GeneGards和CTD數(shù)據(jù)庫，以“coronary heart disease”為檢索詞進行檢索，根據(jù)基因與疾病的相關(guān)度排序，各取前500個靶點，剔除掉重復(fù)的靶點后得到645個靶點蛋白，將這645個靶點和化合物的176個靶點一同導(dǎo)入VENNY在線分析軟件，得到交集靶點22個，見圖2。

圖2 冠心Ⅱ號方化學(xué)成分靶點與冠心病相關(guān)疾病靶點Venny圖

3.4 潛在靶點的拓撲學(xué)分析

為了更直觀地觀察潛在治療靶點之間的關(guān)系，將22個潛在靶點導(dǎo)入string軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，再將得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析。見表2、圖3。如圖3所示，丹參-赤芍藥對對急性心肌梗死作用的潛在靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)有22個節(jié)點，經(jīng)計算后可知，平均連通度約為9.36，平均最短路徑長度在1.2-1.7之間，平均介數(shù)約為0.03，平均聚類系數(shù)約為0.7。度值大的節(jié)點被認為是中心節(jié)點[13]，其中度值（連通度）超過平均數(shù)的節(jié)點有10個，說明這10個節(jié)點作為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，可能是冠心Ⅱ號方治療冠心病的關(guān)鍵靶標。

3.5 相關(guān)通路信息和注釋分析

將22個交集靶點導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫進行GO分析和KEGG分析，經(jīng)過Bonferroni校正P值<0.05,得到75個生物學(xué)過程，包括血壓調(diào)節(jié)、對活性氧的反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控等；13個細胞組成，包括線粒體、細胞外間隙、細胞器膜等；15個分子功能，包括超氧化物歧化酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、生長因子活性等；以及8條信號通路，包括：腫瘤信號通路、FOXO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、ErbB信號通路、和AMPK信號通路等。冠心Ⅱ號方的作用靶點涉及多種生物過程及多條通路，說明冠心Ⅱ號方可以通過調(diào)節(jié)這些生物過程和通路來發(fā)揮治療作用。

表2 冠心Ⅱ號方潛在靶點的拓撲屬性表

圖3 潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.6 分子對接驗證

IGEMDOCK是款開源性的分子對接軟件，一般用于活性篩選和快速對接，IGEMDOCK軟件的分子對接結(jié)果是以能量的高低對化合物結(jié)合程度來判斷的，能量越低，化合物分子與受體結(jié)合的作用可能性越大。臨床研究[14-15]表明丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液治療冠心病療效顯著，不良反應(yīng)少，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液的主要成分是丹參酮ⅡA，本研究以陽性對照藥丹參酮ⅡA打分函數(shù)值作為參考閾值，進行比對分析。分子對接結(jié)果見表3，由表可知冠心Ⅱ號方與22個冠心Ⅱ號方對冠心病的作用靶點結(jié)合性良好，且基本上優(yōu)于丹參酮ⅡA，在這22個靶點中，其中結(jié)合性最強的是GSR與SalvilenoneⅠ，分子結(jié)合模式見圖6。

圖4 冠心Ⅱ號方對冠心病作用靶點的GO分析

4 討論

冠心病是常見的心血管疾病，目前被廣泛應(yīng)用于臨床的西醫(yī)治療手段有經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）、冠狀動脈支架植入術(shù)（ICSI）等，但這些方法存在血管內(nèi)皮損傷及血栓形成、血管炎癥等問題[16]，中醫(yī)藥在防治冠心病方面具有獨特的優(yōu)勢，能夠從多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)干預(yù)冠心病的發(fā)生、發(fā)展，它是從整體治療，具有不良反應(yīng)小、價格低廉、標本兼治等優(yōu)勢[17]。冠心Ⅱ號方是治療冠心病的一個經(jīng)驗方，臨床研究和實驗研究均證實其有顯著的治療效果。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出有效化合物150個，這些化合物包括芍藥苷（paeoniflorgenone）、黃芩素（baicalein）、丹參酮ⅡA（tanshinone iia）、槲皮素(quercetin)等。實驗[18]表明芍藥苷預(yù)處理能降低大鼠微血管內(nèi)皮細胞的凋亡,對微血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮保護作用；黃芩素可抑制血管平滑肌細胞的增殖并促進其凋亡[19]；槲皮素具有抗氧化性，能清除自由基、減少毛細血管脆性、擴張冠狀動脈。這些化合物都與血管上皮細胞、心肌細胞或者脂質(zhì)代謝有關(guān)，由此推測，冠心Ⅱ號方通過這些化合物的協(xié)同作用對冠心病發(fā)揮療效。

圖5 冠心Ⅱ號方對冠心病作用的KEGG氣泡圖

預(yù)測出冠心Ⅱ號方治療冠心病的22個潛在靶點，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)這些靶點共同參與多種生物過程。如BMP2、GSR、HGD、PTGS1、PTGS2、SDHA、SOD2和SOD1共同參與氧化還原反應(yīng)，PTGS1、PTGS2、SOD1、SOD2共同調(diào)控血壓調(diào)節(jié)，而MTOR、PTGS2和SOD2則參與一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控。李慧等[20]研究證明PTGS2可以促進血管平滑細胞的增殖和遷移，同時促進其表型的轉(zhuǎn)化；超氧化物歧化酶SOD1、SOD2是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除人體內(nèi)過多的有害的氧自由，有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化，降低脂質(zhì)過氧化物的含量等作用；IL10是一種重要的抗炎和免疫調(diào)節(jié)因子，對機體的免疫功能和炎癥過程有著重要的調(diào)節(jié)作用；這些生物學(xué)過程均與冠心病的發(fā)生機制有關(guān)，因此推測冠心Ⅱ號方對治療冠心病的作用機制可能與其誘導(dǎo)這些基因表達有關(guān)。

在KEGG分析中，得到8條通路，與冠心病相關(guān)的通路有4條，分別是FOXO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、ErbB信號通路、HIF-1信號通路和AMPK信號通路。FOXOs轉(zhuǎn)錄因子作用復(fù)雜多樣，涉及許多重要的細胞過程，包括氧化應(yīng)激、細胞代謝、參與細胞凋亡和自噬等[21]，心肌FOXOs可通過誘導(dǎo)抗氧化劑和細胞存活途徑在氧化應(yīng)激條件下促進心肌細胞存活，對缺血心肌發(fā)揮保護效應(yīng)[22]，且Foxo蛋白能通過抑制鈣調(diào)磷酸酶/活化T淋巴細胞核因子途徑抑制心肌細胞的增大，在心肌肥大的發(fā)生中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用[23]。NRG1是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白,它能通過激活ErbBs蛋白的受體酪氨酸激酶進行一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，NRG1及其ErbBs受體信號系統(tǒng)在正常心臟的形成和發(fā)育過程中具有決定性的作用[24]。HIF-1是調(diào)節(jié)缺氧的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞穩(wěn)態(tài)、生理學(xué)和疾病中起關(guān)鍵作用[25]，Wei等[26]研究表明HIF-1基因敲除加重壓力超負荷誘導(dǎo)的心肌纖維化、心肌細胞肥大、心肌毛細血管密度降低和心肌細胞凋亡，促進心力衰竭發(fā)生。AMPK是生物體內(nèi)的關(guān)鍵代謝調(diào)節(jié)酶，能調(diào)節(jié)機體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝，維持細胞能量穩(wěn)態(tài)，是目前治療血管疾病的一個重要靶點。在動物實驗中，AMPK的激活能夠降低肥胖的風險和糖尿病相關(guān)的比如胰島素抵抗，代謝綜合征和動脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生率[27]，許多報道已證實AMPK在平滑肌中調(diào)節(jié)血管張力的重要性，以及AMPK功能異常可能會導(dǎo)致高血壓、動脈粥樣硬化和內(nèi)皮功能障礙等[28]。綜上，推測冠心Ⅱ號方通過調(diào)控這些通路對冠心病產(chǎn)生治療作用。

表3 潛在治療靶點與相對應(yīng)的化合物分子對接結(jié)果表

圖6 GSR與salvilenoneⅠ分子對接結(jié)果圖

分子對接結(jié)果按照結(jié)合能由大到小的順序排列見表3，顯示這22個靶蛋白與化合物均能結(jié)合，其中GSR（谷胱甘肽還原酶）與salvilenoneⅠ（沙維烯酮Ⅰ）的結(jié)合性是最好的，谷胱甘肽還原酶是一種幫助保護細胞免受氧化應(yīng)激損壞的酶，機體內(nèi)的自由基和過氧化氫等會產(chǎn)生氧化產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會損害細胞成分，導(dǎo)致細胞變異或加速衰老，而谷胱甘肽還原酶參與氧化還原過程，能將谷胱甘肽返回原來的狀態(tài)，使之繼續(xù)行使細胞抗氧化功能。楊芳[29]等發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化時機體的抗氧化作用減弱，存在氧化應(yīng)激，說明改善機體的氧化還原狀態(tài)有可能減慢或阻止動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。表明冠心Ⅱ號方有效活性成分可能通過與GSR結(jié)合對冠心病發(fā)揮治療作用。其他化合物與靶標也有很好的結(jié)合力，分子對接的結(jié)果也進一步為冠心Ⅱ號方治療冠心病提供了新的思路。

綜上所訴，本研究利用系統(tǒng)藥理學(xué)方法，從整體水平觀察“藥物-靶點-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，挖掘冠心Ⅱ號方的潛在治療靶標、生物學(xué)信息和分子機制，探究冠心Ⅱ號方對冠心病的作用機制。發(fā)現(xiàn)冠心Ⅱ號方主要是通過有效化合物的協(xié)同作用，參與到血壓調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、心肌細胞的代謝等生物學(xué)過程，進一步對冠心病起到干預(yù)作用，與現(xiàn)代藥理研究相符，為進一步從冠心Ⅱ號中提取有效活性成分治療冠心病提供了參考依據(jù)和新的思路。本研究是通過現(xiàn)有的文本挖掘和大數(shù)據(jù)來進行預(yù)測，研究可能存在一些局限性，如網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)尚不全面、數(shù)據(jù)庫不夠完整、評判標準不一的問題，因此，此研究后期有必要通過基礎(chǔ)實驗加以驗證。