廿一味植物藥改善東莨菪堿引起小鼠記憶獲得障礙及其早期安全性研究＊

姜其慧，王云杰，王存芳，余炳勝，曾文彬，張盛濱，龐 濤＊＊

（1.中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院新藥篩選中心 南京210009；2.廣東隆賦藥業(yè)股份有限公司 中山528451）

認(rèn)知功能障礙是指記憶力、言語、執(zhí)行力、空間辨別能力等方面的缺陷，是常見中樞神經(jīng)退行性疾病的早期癥狀，與膽堿能神經(jīng)損傷密切相關(guān)[1]。阿爾茲海默癥（Alzheimer's Disease，AD）[2]的一大典型特征為認(rèn)知障礙，主要發(fā)生在老年人中，占癡呆病例的大多數(shù)。隨著人口老齡化的加劇，AD的發(fā)病率逐年增加[3]。AD顯著降低了患者的生活質(zhì)量，成為一個嚴(yán)重社會問題。

近年來，國內(nèi)外對改善學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行了大量的研究，越來越多的證據(jù)表明多種中藥具有改善學(xué)習(xí)記憶的作用[4]。中藥制劑是幾種不同的活性物質(zhì)的組合，廿一味植物藥是一種復(fù)方制劑，主要成分包括：薤白、人參（人工種植）、葛根、木耳、山楂、桃仁、肉桂、梔子、枸杞子、黃精、干姜、沙棘、菊花、金針菇、桂圓、白芷、藿香、茯苓、甘草、丁香、烏藥葉。其中肉桂屬樟科常綠喬木植物，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為肉桂具有“補(bǔ)元陽、暖脾胃、除積冷、通血脈”的作用[5]。中華本草中記載[6]，肉桂具有增加冠狀動脈及腦血流量的作用，肉桂的主要成分肉桂醛可減少神經(jīng)炎癥和減輕認(rèn)知功能障礙，具有抗炎，抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用[7]。

桃仁是薔薇科植物桃的干燥成熟種子[8],在中國有著豐富的資源，桃仁味甘、苦、性平，具有活血化瘀、改善血液循環(huán)、抗炎、保肝等功效[9]。桃仁的主要成分為復(fù)雜的脂肪酸[10]，其不飽和脂肪酸含量最多可達(dá)到93%，可增加腦灌流液的流量，改善血流動力，發(fā)揮改善記憶的功效。人參是五加科植物人參的根,屬于中藥上品，性溫、微寒、味甘、無毒，在我國用藥史上有著兩千多年的歷史；《神農(nóng)本草經(jīng)》[11]對其有“安精神、開心益智”的功效描述。人參皂苷是人參的主要活性成分，被認(rèn)為是人參發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。金針菇又名冬菇，隸屬擔(dān)子菌亞門層菌綱，元代的《農(nóng)書》[12]記載金針菇形美、味鮮，并含有多種功能成分。其中氨基酸如谷氨酸對傳遞神經(jīng)信號沖動，維護(hù)腦及神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)揮重要作用；金針菇多糖[13]已被報導(dǎo)可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群組成進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶功能，而干姜、茯苓等成分具有補(bǔ)脾健肺、安神益智的功效[14]。

東莨菪堿作為M膽堿能受體阻斷劑[15]，是一種莨菪烷生物堿化合物，能抑制大腦皮層乙酰膽堿傳遞，引起記憶獲得障礙。本實驗在訓(xùn)練前給予小鼠東莨菪堿，造成記憶獲得障礙模型，利用避暗和跳臺等行為學(xué)實驗相關(guān)指標(biāo)測定廿一味植物藥對學(xué)習(xí)記憶的改善作用，并觀測廿一味植物藥的初步毒性，為后期開發(fā)改善學(xué)習(xí)記憶作用的醒腦保健品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級ICR雄性小鼠84只，體重25-28 g，購自南京江寧區(qū)青龍山實驗動物繁育中心（合格證號：SCXK（蘇）2017-0001），飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)玄武校區(qū)藥學(xué)動物實驗中心清潔級動物房，并接受環(huán)境適應(yīng)3 d，將動物保持在25±2℃的環(huán)境溫度和55±2%的濕度下，在自由獲取食物和水的條件下，進(jìn)行12 h的光/暗循環(huán)。所有實驗均在江蘇省實驗動物管理委員會和中國藥科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 實驗藥物

廿一味植物藥是一種廿一味中藥植物復(fù)方功能制劑，由廣州隆賦腦多肽生物科技有限公司生產(chǎn)提供的成藥（批號：190401）。

1.3 主要儀器與試劑

儀器：避暗穿梭一體機(jī)（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）；Varioskan Flash全波長酶標(biāo)儀（美國ThermoFisher）；氫溴酸東莨菪堿（上海皓元醫(yī)藥股份有限公司）；R500通用型小動物麻醉機(jī)（瑞沃德生命科技有限公司）；4℃離心機(jī)（美國ThermoFisher）；異氟烷氣體麻醉劑（瑞沃德生命科技有限公司）；TC（總膽固醇）、TG（甘油三酯）、ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、LDH（乳酸脫氫酶）、α-HBDH（α-羥基丁酸脫氫酶）、CK（肌酸激酶）、UREA（尿素）等檢測試劑盒均購自于上海科華生物工程股份有限公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（美國Life technologies公司）；RNA逆轉(zhuǎn)錄儀（美國Bio-Rad公司）；Nanodrop 2000核酸定量儀（美國ThermoFisher）；總谷胱甘肽檢測試劑盒（碧云天）；脂質(zhì)氧化（MDA）檢測試劑盒（碧云天）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑（諾唯贊）；內(nèi)參18SrRNA引物、BDNF引物均購自于上海生工生物公司。

1.4 動物分組與給藥

84只ICR小鼠中24只用于安全性試驗，60只分成兩批次用于學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)測定。

24只小鼠每籠6只，適應(yīng)環(huán)境3 d。適應(yīng)后編號，稱重，隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為空白對照組，給藥高、中、低劑量組。給藥組高、中、低劑量分別為2 g·kg-1，1 g·kg-1，0.1 g·kg-1，灌胃給藥，稱取廿一味植物藥適量，溶于適量生理鹽水，使每只小鼠的灌胃體積保持在0.2 mL左右，且隨著小鼠體重的增加，調(diào)整灌胃藥物的濃度；空白對照組等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃28 d。

30只小鼠每籠6只，適應(yīng)環(huán)境3 d。適應(yīng)后編號，稱重，隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為空白對照組，模型組，給藥高、中、低劑量組。給藥方式同上，空白對照組及模型組給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃28 d，用于小鼠避暗實驗。另外30只小鼠按照以上分組用于小鼠跳臺實驗。

1.5 安全性試驗

每周稱量小鼠的體重，統(tǒng)計體重變化差異。取血前使用R500通用型小動物麻醉機(jī)和異氟烷麻醉劑進(jìn)行麻醉，2%-3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉后，摘眼球取血1 mL，靜置4 h，4℃，7000 g，離心20 min，取上部分血清，于-80℃冰箱保存。根據(jù)各試劑盒說明書測定各臟器毒性指標(biāo)變化，其中肝臟毒性指標(biāo)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG），心臟毒性指標(biāo)為谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）及α-羥基丁酸脫氫酶（α-HBDH），腎臟毒性指標(biāo)為尿素（UREA）；安樂死后取心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺、腦組織等器官，測定臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%；同時取各臟器進(jìn)行H&E染色，觀察組織病變情況。

1.6 行為學(xué)測試

1.6.1 小鼠避暗實驗[16]

連續(xù)灌胃28 d，末次給藥1 h后，除空白對照組外各組（空白對照組腹腔注射生理鹽水）腹腔注射東莨菪堿5 mg·kg-1[17]，30 min后將小鼠背向洞口放入一體機(jī)的明室內(nèi)，同時按下計時器開始計時。一體機(jī)分為兩個相同體積的明、暗室體，明、暗室由一個洞口相連，小鼠有趨暗的習(xí)性，傾向于穿過洞口進(jìn)入暗室，暗室接有40 V的電壓，小鼠進(jìn)入暗室受到電擊后退回明室，并產(chǎn)生暗室有電的短暫性記憶。將每只小鼠訓(xùn)練5 min，并記錄每只小鼠第一次進(jìn)入暗室的潛伏期（開始放入明室到進(jìn)入暗室受到電擊的時間）及5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)。24 h后重新測試，記錄每只小鼠第一次進(jìn)入暗室的潛伏期和5 min內(nèi)每只小鼠受到的電擊次數(shù)。

1.6.2 小鼠跳臺實驗[18]

連續(xù)灌胃28 d，末次給藥1 h后，除空白對照組外（空白對照組腹腔注射生理鹽水）各組腹腔注射東莨菪堿5 mg·kg-1，30 min后將小鼠放入一體機(jī)平臺上適應(yīng)環(huán)境3 min，平臺下接通40 V的電壓。小鼠具有探索空間的習(xí)性，傾向于跳下平臺進(jìn)入銅柵上而受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺躲避電擊，但多數(shù)小鼠在第一次受到電擊后會再次跳下平臺，接著受到電擊，在反復(fù)循環(huán)訓(xùn)練多次后，小鼠會產(chǎn)生銅柵有電的短暫記憶。將小鼠放在平臺上，接上電源，同時按下計時器開始計時，記錄各組小鼠第1次跳下平臺的時間即潛伏期，以及每組小鼠3 min跳下平臺受到電擊的次數(shù)即錯誤次數(shù)。24 h后重新測試，記錄每只小鼠第1次從平臺跳下受到電擊的潛伏期和3 min內(nèi)的錯誤次數(shù)。

1.7 ICR小鼠海馬組織BDNF mRNA、總谷胱甘肽、MDA的檢測

實時熒光定量PCR檢測海馬組織BDNF mRNA表達(dá)。在行為學(xué)實驗結(jié)束后，使用小型麻醉機(jī)和麻醉劑異氟烷麻醉小鼠，生理鹽水灌流后，精密稱取10 mg小鼠腦部海馬組織，加入適量RNA提取試劑Trizol勻漿后提取RNA，使用核酸定量儀測定樣品RNA的濃度；使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，然后進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物有限公司合成，內(nèi)參18SrRNA引物序列為：上游引物（Forward）：CTTAGAGGGACAAGTGGCG；下游引物（Reverse）：ACGCTGAGCCAGTCAGTGTA；BDNF上游引物序 列（Forward）：TCATACTTCGGTTGCATG-AAGG；下游引物序列（Reverse）：AGACCTCTCGAACCTGCCC。擴(kuò)增體系為20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃，10 s；60℃，30 s；共40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后通過溶解曲線確認(rèn)引物特異性，通過CT值計算目的基因相對表達(dá)量。另分別精確稱取10 mg小鼠腦海馬組織，加入相應(yīng)的試劑盒勻漿液，制成10%的組織勻漿液；4℃，10 000×g，離心10 min后取上清，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量組織裂解液蛋白濃度。根據(jù)總谷胱甘肽檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒說明書分別檢測其含量。

1.8 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所測表格數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD表示，圖數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）；各指標(biāo)組間比較均采用單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Bonferroni檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 安全性試驗

2.1.1 給藥前后各組小鼠體重比較

隨著時間的變化，各組小鼠體重顯著增加，而與空白對照組相比，給藥高、中、低劑量組小鼠體重均無明顯差異（P>0.05）（表1）。

表1 小鼠28 d的體重變化(n=6)

2.1.2 臟器系數(shù)

隨著周齡的增長，ICR小鼠的臟器質(zhì)量和體重在逐漸增加，各組小鼠的臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%）并無明顯差異（P>0.05）（圖1）。

2.1.3 臟器毒性指標(biāo)

與空白對照組相比，各濃度的廿一味植物藥對肝臟毒性指標(biāo)ALT、TC、TG，心臟毒性指標(biāo)AST、LDH、CK、α-HBDH及腎臟的毒性指標(biāo)UREA均未造成顯著改變（P>0.05）（圖2）。

圖1 小鼠的臟器系數(shù)

表2 廿一味植物藥對東莨菪堿引起的記憶獲得障礙模型小鼠避暗實驗（n=6）

2.1.4 H&E染色結(jié)果

用蘇木精和伊紅（H&E）染色觀察各臟器病理變化，發(fā)現(xiàn)心臟空白對照組小鼠心肌纖維排列規(guī)則，細(xì)胞核質(zhì)均一，心肌細(xì)胞周圍炎性細(xì)胞浸潤少，給藥高、中、低劑量組與正常組相比均無明顯變化。肝臟空白對照組肝細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核居中且大而圓，異染色質(zhì)少而著色淺，可以看到明顯核仁，肝小葉形態(tài)完整，給藥組與對照組相比無明顯變化。脾臟空白對照組結(jié)構(gòu)正常，濾泡數(shù)量豐富，形態(tài)飽滿，與空白對照組相比給藥高、中、低劑量組均無明顯變化。肺空白對照組支氣管粘膜上皮及肺泡無變形，無細(xì)胞脫落，無炎性細(xì)胞滲出、聚集；與空白對照組相比，給藥高、中、低劑量組均無明顯變化。腎臟空白對照組鏡下可見結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，腎小球數(shù)量豐富，形態(tài)飽滿；與空白對照組相比，給藥高、中、低劑量組均無明顯變化。腦空白對照組皮層部位神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，數(shù)量豐富，排列整齊；與空白對照組相比，給藥高、中、低劑量組均無明顯變化（圖3）。

2.2 廿一味植物藥改善小鼠記憶獲得障礙的作用分析

2.2.1 避暗試驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，造模組小鼠的記憶潛伏期顯著地縮短（P<0.001），5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)顯著增加（P<0.001），表明造模成功。而與模型組小鼠相比，廿一味植物藥低劑量組小鼠的記憶潛伏期顯著延長（P<0.01）；高、中劑量組小鼠的記憶潛伏期極顯著延長（P<0.001），且各劑量組小鼠的錯誤次數(shù)顯著減少（P<0.01）（表2）。

2.2.2 跳臺試驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，造模組小鼠的記憶潛伏期明顯縮短（P<0.001），錯誤次數(shù)顯著增加（P<0.001），說明造模成功。而與模型組相比，廿一味植物藥高、中、低劑量組小鼠潛伏期顯著延長（P<0.001），錯誤次數(shù)顯著減少（P<0.001）。這些結(jié)果說明廿一味植物藥可改善東莨菪堿引起的記憶獲得障礙（表3）。

2.3 廿一味植物藥對記憶障礙小鼠腦海馬BDNFmRNA、總谷胱甘肽、MDA的含

與空白對照組比較，模型組BDNF mRNA、總谷胱甘肽、MDA含量出現(xiàn)明顯改變。與模型組相比，廿一味植物藥中、高劑量組BDNF mRNA和總谷胱甘肽含量顯著升高（P<0.01）、MDA含量顯著降低（P<0.001）（圖4）。

圖2 小鼠的臟器毒性指標(biāo)

表3 廿一味植物藥對東莨菪堿引起的記憶獲得障礙模型小鼠跳臺實驗（n=6）

3 討論

學(xué)習(xí)記憶是腦的高級功能之一，是衡量動物智力發(fā)育的重要指標(biāo)[19]。學(xué)習(xí)記憶是通過神經(jīng)系統(tǒng)一系列生理生化過程實現(xiàn)的，其作用減退可能與腦膽堿能系統(tǒng)損傷及氧化應(yīng)激有關(guān)[20]，改善記憶功能是預(yù)防阿爾茲海默癥的重要手段。

現(xiàn)階段，對于治療AD患者的藥物主要有神經(jīng)保護(hù)藥、抗氧化藥、抗炎癥藥物等。但是，這些藥物只能從單方面進(jìn)行治療，進(jìn)而改善記憶作用，而且其副作用大，藥物昂貴。由于阿爾茲海默癥病理機(jī)制復(fù)雜，具有多靶點多途徑的特點，因此使用中藥復(fù)方制劑可以在治療效果方面具有更高的優(yōu)勢。本研究利用中藥制劑的多種有效成分協(xié)同發(fā)揮作用，使改善記憶效果達(dá)到最佳，符合中醫(yī)藥治療特色。

廿一味植物藥中有多種成分具有益智健腦的作用，其中肉桂中的主要成分肉桂醛能夠顯著改善大腦功能，有助于記憶力的提升[21]；桃仁能夠顯著改善腦血流量，從而提高記憶能力[22]；金針菇多糖可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群起到改善記憶功能的作用；人參具有大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺，生津，安神的作用，其主要成分人參皂苷具有益氣補(bǔ)腦的作用[23]。茯苓味甘、淡、性平，入藥具有利水滲濕、益脾和胃、寧心安神之功用。幾味藥物合用，可達(dá)到舒張腦部血管，改善腦功能的作用。

圖3 小鼠各臟器的H&E染色切片

膽堿能功能障礙是AD患者記憶損傷的主要原因之一[24]。東莨菪堿是一種M膽堿能受體阻斷劑，阻斷腦乙酰膽堿（Ach）生成，抑制大腦信息的傳遞，從而模擬AD的記憶受損癥狀，目前常用做開發(fā)AD或記憶障礙藥物的動物模型。避暗實驗和跳臺實驗為經(jīng)典的行為學(xué)檢測方法[25]，避暗實驗是利用小鼠具有趨暗避明的習(xí)性而設(shè)計的一種實驗，而跳臺實驗是利用小鼠具有探索空間的能力而設(shè)計的一種實驗，兩者都可以用于評估恐懼驅(qū)動的記憶檢索[26]。本研究預(yù)防性給藥28 d，采用東莨菪堿引起小鼠記憶獲得性障礙，采用避暗實驗和跳臺實驗進(jìn)行模型及給藥效果的比較。實驗結(jié)果表明，避暗實驗和跳臺實驗中模型組小鼠進(jìn)入暗室及跳下平臺的潛伏期明顯縮短，且進(jìn)入暗室及跳下平臺的錯誤次數(shù)明顯增加。廿一味植物藥高、中、低劑量都能顯著延長未成年小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期，減少小鼠的錯誤次數(shù)，改善東莨菪堿引起的記憶獲得性障礙，提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；且早期安全性研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠各臟器方面，廿一味植物藥高、中、低劑量都無毒副作用。

圖4 小鼠海馬組織BDNF mRNA、總谷胱甘肽、MDA的含量測定

BDNF[27]是一種腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，BDNF及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，具有神經(jīng)營養(yǎng)、保護(hù)神經(jīng)的作用?？偣入赘孰腫28]包括還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，其中還原型谷胱甘肽是動物細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑，而總谷胱甘肽中通常有90-95%為還原型谷胱甘肽。MDA是生物體脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時會發(fā)生脂質(zhì)氧化。因此可以通過檢測MDA的含量反應(yīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的水平。實驗結(jié)果表明，廿一味植物藥高、中劑量組可以顯著增加BDNF mRNA的含量，起到腦神經(jīng)保護(hù)作用；同時廿一味植物藥高、中劑量組也能顯著增加總谷胱甘肽的含量，降低MDA的含量，進(jìn)一步證明廿一味植物藥改善學(xué)習(xí)記憶作用可能是通過增加腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗氧化發(fā)揮作用，其具體的作用分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

廿一味植物藥是我們目前進(jìn)行研究的一組方劑，通過以上的研究顯示出其具有一定的記憶改善作用，但由于本方劑中含有藥物種類較多，無法分析是由于哪種或哪幾種藥物起到提升記憶的作用。因此，在今后的實驗中，我們將會對本方劑中的一種或幾種不同藥物的配伍進(jìn)行提升記憶力的研究，并尋找有效物質(zhì)成分，期待能夠找到更好的改善記憶的方劑或藥效物質(zhì)，為改善記憶障礙相關(guān)腦疾病提供理論和實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，廿一味植物藥能夠顯著減輕東莨菪堿引起的記憶障礙，在灌胃給予2 g·kg-1時仍未表現(xiàn)出毒副作用，具有良好的安全性，而且其作用效果可能與神經(jīng)保護(hù)和抗氧化有密切關(guān)系，值得臨床前深入開發(fā)研究。