Synapsin1磷酸化參與開心散改善Aβ誘發(fā)的小鼠記憶障礙＊

張 博，黃樹明＊＊，徐紅丹，劉學(xué)偉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)/佳木斯學(xué)院佳木斯154007；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院/藥學(xué)院 齊齊哈爾161006）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已成為世界生命科學(xué)領(lǐng)域的難題之一[1]。β淀粉樣蛋白（amyloidβ，Aβ）是AD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]，其可溶性的寡聚體具有極強(qiáng)的神經(jīng)毒性并引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3-4]，但目前尚無切實(shí)可行的治療AD的對(duì)策。

開心散（Kaixin-San，KXS）始見于唐代《備急千金要方》，由“遠(yuǎn)志、人參、茯苓、石菖蒲”組成，具有“主好忘”之功。大量研究證實(shí)開心散能夠改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，但目前關(guān)于開心散改善記憶障礙的研究多從抗氧化、保護(hù)神經(jīng)元、抑制乙酰膽堿酯酶等角度出發(fā)[5]，缺乏關(guān)鍵的內(nèi)在機(jī)制的研究，而本實(shí)驗(yàn)從內(nèi)在機(jī)制角度出發(fā)進(jìn)行研究，以深入闡明開心散改善記憶能力的作用機(jī)制。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的電生理學(xué)基礎(chǔ)，是記憶形成的關(guān)鍵，其形成過程需要突觸前膜和突觸后膜相關(guān)機(jī)制的共同參與，即突觸前膜遞質(zhì)釋放和（或）突觸后膜反應(yīng)的敏感性。我們課題組前期研究證實(shí)開心散可改善Aβ誘發(fā)的突觸可塑性抑制[6]，且在突觸后膜機(jī)制方面，谷氨酸受體2蛋白介導(dǎo)了這一過程[7]，但對(duì)于突觸前膜機(jī)制尚未見到相關(guān)的報(bào)道，而本研究將重點(diǎn)錨定在突觸前膜機(jī)制上。突觸蛋白（Synapsin，SYN）是突觸囊泡功能調(diào)節(jié)的重要蛋白，其是否磷酸化極大的影響突觸后膜囊泡遞質(zhì)的釋放率，同時(shí)遞質(zhì)釋放是突觸前膜相關(guān)受體蛋白發(fā)生功能和結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)，因此為探討開心散改善突觸可塑性抑制的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過觀察開心散對(duì)模型小鼠行為學(xué)，突觸前膜遞質(zhì)釋放效率及突觸前膜磷酸化突觸蛋白1（phospho-SYN1，p-SYN1）和 突 觸 蛋 白1（Synapsin1，SYN1）蛋白表達(dá)的影響，明確開心散影響學(xué)習(xí)記憶能力的突觸前膜分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 周齡雌性ICR小鼠（30±5 g），購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK（黑）2008-004。常規(guī)飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境中，溫度為24±2℃，濕度為55±5%，12 h晝夜交替。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照科技部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理指南》執(zhí)行，且經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

人參（Panax ginsengC.A.Mey.）、茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifoliaWilld.）、石菖蒲（Acorus tatarinowiiSchott）均購(gòu)自北京同仁堂藥店，并由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)王喜軍教授鑒定。人參、茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲按3∶3∶2∶2比例組成。依據(jù)課題組前期提取工藝的研究結(jié)果，即：以浸出物收率總皂苷為質(zhì)量控制的主要指標(biāo)，根據(jù)正交設(shè)計(jì)及方差分析，確定最佳提取工藝為用10倍量的60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，濾過，藥液濃縮至相對(duì)密度為1.10（60℃）的清膏，減壓（真空度為0.06-0.075 MPa）于60℃干燥箱內(nèi)干燥至恒重，粉碎成細(xì)粉，凍存，備用。此工藝條件下浸出物收率為27.6%，總皂苷含量為5.26%。

Aβ1-42（Sigma，A9810），全蛋白提取試劑盒（Solarbio，BC3710）,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，P0012S），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solarbio，P1200），兔源SYN1一抗（Bioss，bs-3501R），兔源p-SYN1（Ser9）(Bioss，bs-3289R)，β-actin（Bioss，bs-0061R），辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（中杉金橋，ZB-2301），超敏ECL發(fā)光液（MA0186，大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），刺激電極（SNEX100同軸雙極金屬電極，KOPF公司），記錄電極，放大器（DAM80，World Precision Instruments），刺激輸出裝置（SS-104J，NIHON KOHDEN），電刺激隔離器（SEN-80203，NIHON KOHDEN），數(shù)據(jù)獲取裝置（Digidata 1440A，Molecular Device），雙目萬向支架體視顯微鏡（ZX-0745-1W，深圳市眾尋光學(xué)儀器有限公司），穩(wěn)壓電源（DJW-1000，上海全力電器有限公司），自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀（Thermo Fisher），Western-blot儀器包括電源，電泳槽，轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)均來自BioRad公司。

1.4 模型制備及給藥

小鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組，模型（Aβ）組和開心散（Aβ/KXS）組。小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉45 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，固定于小鼠腦立體定位儀上，頭部備皮，消毒手術(shù)區(qū)皮膚，沿頭部正中線做1 cm-1.5 cm切口，暴露前囟及人字溝，剝離骨膜。參照《小鼠腦立體定位圖譜》[8]定位側(cè)腦室，在前囟后1 mm，中線旁開1.75 mm，用骨鉆在顱骨上鉆孔，暴露硬腦膜，微量注射器垂直腦表面進(jìn)針1.8 mm，向單側(cè)腦室緩慢注入5μL Aβ1-42（濃度為500μM的Aβ1-42用生理鹽水稀釋成濃度為1μM），進(jìn)針5 min，留針5 min，以防液體溢出。對(duì)照組在相同位置注射等體積生理鹽水。Aβ及Aβ/KXS組均在側(cè)腦室注射Aβ1-42。Aβ/KXS組小鼠于造模前7天給予開心散灌胃0.2 mL（0.15 g·kg-1），對(duì)照組及Aβ組給予等體積生理鹽水灌胃，每日一次，持續(xù)至電生理學(xué)測(cè)試當(dāng)天。因預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)開心散低、中、高劑量組小鼠進(jìn)行了學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)開心散中、高劑量組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，也就是開心散中劑量即為有效劑量，因此本實(shí)驗(yàn)選用開心散中劑量，即0.15 g·kg-1的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

表1 開心散對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（n=10）

造模前、后分別對(duì)各組小鼠進(jìn)行測(cè)試，將基礎(chǔ)智力和體力不合格者予以剔除。水迷宮測(cè)試分為兩部分：①定位航行實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)放在第Ⅰ象限中間，在每個(gè)象限（4個(gè)象限）固定一點(diǎn)面向水池池壁將小鼠放入水中，每個(gè)象限各測(cè)試一次，每次測(cè)試60 s。若小鼠在60 s之內(nèi)尚未找到平臺(tái)，則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上并使它在平臺(tái)上停留10 s，若小鼠在60 s之內(nèi)找到平臺(tái)，也讓其在平臺(tái)上停留10 s，方結(jié)束一次訓(xùn)練，如此訓(xùn)練5天。第5天訓(xùn)練時(shí)小鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期。②空間探索實(shí)驗(yàn)：第5天訓(xùn)練結(jié)束后，將平臺(tái)移走，2 h后將每組小鼠從固定象限（第Ⅱ象限）的一點(diǎn)放入水中，記錄每只小鼠在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.5.2 新奇事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)

小鼠在鼠籠適應(yīng)5 min后，將2個(gè)體積基本相同的不同物體（A、B）放入鼠籠，分別觀察并記錄小鼠在10 min內(nèi)對(duì)A、B進(jìn)行探索的時(shí)間，計(jì)算探索偏好指數(shù)a（%）=【（B/A+B）】×100。實(shí)驗(yàn)室保持安靜，避免強(qiáng)光刺激。24 h后，將物體（A）和新物體（C）放入籠中，分別觀察并記錄小鼠對(duì)A、C進(jìn)行探索的時(shí)間，計(jì)算探索偏好指數(shù)b（%）=【（C/A+C）】×100。

1.5.3 電生理學(xué)測(cè)定

將已麻醉的小鼠固定于小鼠腦立體定位儀上，用骨鉆分別于刺激及記錄電極處鉆孔備用，實(shí)驗(yàn)中用電熱毯維持動(dòng)物體溫于37℃。記錄電極采用玻璃微電極，內(nèi)充滿生理鹽水，電極尖端內(nèi)徑以電極電阻小于3 M歐姆為準(zhǔn)；刺激電極采用同軸雙極金屬電極。突觸后電位的記錄選擇研究海馬突觸可塑性常用perforant pathway（PP）—齒狀核（dentate gyrus，DG）通路，實(shí)驗(yàn)時(shí)利用微推進(jìn)裝置將電極插入預(yù)定的刺激/記錄部位。測(cè)定PP-DG通路突觸后電位時(shí)，電極插入后刺激電極的尖端定位在海馬perforant pathway側(cè)枝處，坐標(biāo)為Bregma后4.5 mm、中線右側(cè)旁開3.0 mm，深度為皮層下1.5-2.0 mm；記錄電極尖端定位在DG區(qū)分子層，坐標(biāo)為Bregma后2.1 mm、中線右側(cè)旁開1.5 mm，深度為皮層下1.75-2.25 mm；參考電極固定于后頭部皮膚表面。放大器濾過低于10 Hz及高于3 kHz的波。

基礎(chǔ)電刺激強(qiáng)度以誘發(fā)場(chǎng)興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）最大振幅的30%作為基準(zhǔn)。待基線記錄穩(wěn)定15 min后，給予1串100個(gè)脈沖組成的高頻刺激（100 Hz，1 sec），然后觀察并記錄電刺激后第一分鐘的fEPSP鋒電位（population spike，PS）振幅，數(shù)據(jù)以PS振幅的百分比表示。

采用Clampex 10.2軟件記錄fEPSP波形。記錄完成后，用Clampfit 10.2軟件分析上述記錄到的波形獲得并處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（±S.E.）表示。

1.5.4 突觸前膜p-SYN1和SYN1蛋白含量檢測(cè)

將前期電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束凍存的各組刺激側(cè)小鼠海馬組織冰上裂解，離心取上清液。BCA蛋白濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，測(cè)定各組小鼠海馬組織的蛋白濃度，依據(jù)測(cè)定的蛋白濃度按比例向各組組織中加入4×上樣緩沖液，煮沸，離心。配制8%分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣20μg制備好的蛋白樣品。上層膠70 V，電泳30 min，下層膠110 V，電泳1 h。濕轉(zhuǎn)儀外部置于冰水中，100 V濕轉(zhuǎn)2 h，TBST緩沖液洗5 min×1次。室溫封閉液封閉1 h，p-SYN1和SYN1一抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗5 min×5次。二抗（1:5000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗5 min×5次。ECL發(fā)光液室溫孵育1min，凝膠成像系統(tǒng)曝光成像并進(jìn)行體積分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 開心散對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮定位航行試驗(yàn)第5天，記錄各組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)如圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，Aβ組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P<0.05），說明Aβ?lián)p傷了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。與Aβ組相比較，Aβ/KXS組小鼠避潛伏期明顯縮短（P<0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P<0.05），說明開心散改善了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提示開心散可改善Aβ誘發(fā)的記憶障礙。

圖1 各組小鼠水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)軌跡示意圖

2.1.2 新奇事物認(rèn)知實(shí)驗(yàn)

新奇事物認(rèn)知訓(xùn)練當(dāng)天及24 h后，記錄各組小鼠探索偏好指數(shù)，分別為探索偏好指數(shù)a及探索偏好指數(shù)b，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，訓(xùn)練當(dāng)天Aβ組與對(duì)照組的探索偏好指數(shù)a及Aβ/KXS組與Aβ組的探索偏好指數(shù)比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。24小時(shí)后，放入新物體C后，與對(duì)照組比較，Aβ組小鼠對(duì)C物體的探索偏好指數(shù)b明顯降低（P<0.05），即Aβ組小鼠對(duì)物體A和C的探索時(shí)間接近。而與Aβ組比較，Aβ/KXS組小鼠探索偏好指數(shù)b明顯增加（P<0.05），即Aβ/KXS組小鼠對(duì)物體C的探索時(shí)間明顯增加。說明Aβ?lián)p傷了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，而開心散改善了Aβ所致的記憶損害。

2.2 開心散對(duì)模型小鼠突觸前膜遞質(zhì)釋放效率的影響

fEPSP波形穩(wěn)定基礎(chǔ)記錄15 min后，給予一串高頻刺激所誘發(fā)PS振幅增加的第一分鐘，間接反映的就是突觸前膜遞質(zhì)釋放效率，見表3。電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（n=20）相比，Aβ組小鼠PS振幅降低（P<0.05），與Aβ組（n=6）相比，Aβ/KXS組（n=7）小鼠PS振幅明顯增加（P<0.05），說明Aβ抑制了突觸前膜遞質(zhì)釋放效率，而開心散可改善Aβ對(duì)突觸前膜遞質(zhì)釋放效率的抑制作用。

2.3 開心散對(duì)模型小鼠海馬突觸前膜蛋白SYN1及p-SYN1表達(dá)的影響

Western-blot結(jié)果顯示，Aβ組小鼠海馬p-SYN1表達(dá)下降，且p-SYN1/SYN1灰度比值為0.31±0.04，與對(duì)照組（0.56±0.09）比較，數(shù)值明顯降低（P<0.05），說明Aβ抑制了SYN1磷酸化，提示磷酸化的SYN1（Ser9）可能參與了Aβ對(duì)小鼠海馬突觸可塑性的抑制。Aβ/KXS組小鼠海馬p-SYN1表達(dá)相對(duì)增多，且p-SYN1/SYN1灰度比值為0.58±0.05，與Aβ組相比較，比值明顯升高（P<0.05），說明開心散增加了SYN1的磷酸化，且逆轉(zhuǎn)了Aβ所致的p-SYN1/SYN1的比值下降，提示開心散可能通過促進(jìn)SYN1磷酸化進(jìn)而改善Aβ誘發(fā)的突觸可塑性抑制從而改善學(xué)習(xí)記憶能力（見圖2）。而在圖中SYN1顯示的雙條帶可能與其具有至少2個(gè)亞型有關(guān)。

表2 開心散對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響（n=10）

表3 開心散對(duì)模型小鼠突觸前膜遞質(zhì)釋放效率的影響

3 討論

AD患者的臨床表現(xiàn)之一即記憶力減退，而Aβ是其發(fā)病的關(guān)鍵，具有神經(jīng)毒性，嚴(yán)重?fù)p害患者記憶和認(rèn)知功能。目前建立AD動(dòng)物模型的方法有很多包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、Aβ腦內(nèi)注射等[9-10,11,12]，以模擬與AD患者病理表現(xiàn)相似的腦內(nèi)Aβ聚集，進(jìn)而研究AD的發(fā)病機(jī)制。截至目前，通過復(fù)制AD模型動(dòng)物已有大量行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Aβ可損傷AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能[13]，并通過多個(gè)環(huán)節(jié)起作用[14-15]，而Aβ腦內(nèi)注射是目前研究最多，應(yīng)用最廣泛的AD動(dòng)物模型造模方法，故本實(shí)驗(yàn)采用Aβ腦內(nèi)注射的造模方法復(fù)制AD動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)通過兩種行為學(xué)檢測(cè)方法共同證實(shí)，在基礎(chǔ)智力無差異的情況下，Aβ所致AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組小鼠明顯下降，表明Aβ能夠損傷學(xué)習(xí)記憶能能力，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

圖2 突觸前膜p-SYN1及SYN1蛋白表達(dá)的Western-blot結(jié)果

中藥復(fù)方具有多因素，多靶點(diǎn)，多途徑的作用特點(diǎn)，因此在治療AD上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。經(jīng)方開心散中以人參、茯苓，大補(bǔ)元?dú)?，滋補(bǔ)脾腎，淡滲利濕，維護(hù)先后天之本；遠(yuǎn)志、菖蒲安神定志，化痰祛邪以開竅，從而達(dá)到益氣扶正，化痰祛邪的治療目的。臨床研究發(fā)現(xiàn)開心散變化方能有效改善AD患者認(rèn)知功能方面的臨床癥狀[16]，且大量實(shí)驗(yàn)通過行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)開心散具有改善模型動(dòng)物記憶障礙的作用[9-10,17]，本研究通過多種行為學(xué)方法亦證實(shí)在各組小鼠基礎(chǔ)智力無差異的情況下，Aβ/KXS組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較Aβ組小鼠有所改善，說明開心散可改善Aβ誘發(fā)的小鼠記憶障礙，這與前期研究結(jié)果相一致[7]。

盡管大量實(shí)驗(yàn)表明開心散可提高AD模型動(dòng)物記憶力，且可通過多途徑治療AD，但關(guān)于開心散對(duì)突觸信息傳遞功能可塑性的影響報(bào)道較少，僅日本學(xué)者于1994年報(bào)道開心散可促進(jìn)大鼠海馬齒狀核長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的形成，從而改善乙醇所致記憶障礙模型大鼠學(xué)習(xí)缺陷[18]，而其也證明開心散復(fù)方各組分藥物中人參和茯苓起到了增強(qiáng)海馬LTP的作用[19]。但開心散對(duì)AD模型動(dòng)物L(fēng)TP的影響及其影響LTP的機(jī)制未見報(bào)道，然而我們課題組前期研究證實(shí)開心散可改善AD模型動(dòng)物突觸可塑性[7]。

突觸之間信息傳遞主要是由突觸前末梢突觸囊泡所釋放的遞質(zhì)介導(dǎo)，SYN是突觸囊泡中含量最為豐富的跨膜蛋白，其含有多個(gè)亞型，其中SYN1在突觸小泡移動(dòng)方面起主要作用，同時(shí)SYN也是突觸囊泡的特異性標(biāo)志蛋白，是突觸囊泡功能調(diào)節(jié)的最重要的分子之一并參與遞質(zhì)釋放[20]。通常情況下突觸囊泡由突觸蛋白錨定于細(xì)胞骨架絲上，當(dāng)軸漿內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí)，引發(fā)一系列反應(yīng)，促使突觸蛋白Ser9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而與骨架絲結(jié)合力減弱，突觸囊泡游離，促進(jìn)遞質(zhì)釋放[21-22]。遞質(zhì)大量釋放后，相關(guān)遞質(zhì)與突觸后膜受體結(jié)合，啟動(dòng)突觸后膜機(jī)制，增強(qiáng)突觸可塑性[23]。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的電生理學(xué)基礎(chǔ)[24]，突觸可塑性的發(fā)生主要涉及突觸前膜機(jī)制和突觸后膜機(jī)制，課題組前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在開心散改善Aβ誘發(fā)的突觸可塑性抑制的過程中，突觸后膜相關(guān)機(jī)制起到重要作用[7]，但突觸前膜機(jī)制并不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)通過電生理學(xué)方法間接測(cè)定了突觸前膜遞質(zhì)釋放效率，如果開心散對(duì)突觸前膜遞質(zhì)釋放效率有影響，那么本研究將采用Western-blot法重點(diǎn)檢測(cè)突觸前膜p-SYN1（Ser9）和SYN1蛋白表達(dá)的改變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在給予高頻刺激第1分鐘，即強(qiáng)直后增強(qiáng)期，Aβ組小鼠PS振幅明顯降低，說明Aβ抑制了突觸前膜遞質(zhì)釋放，而開心散組小鼠PS振幅明顯升高，說明開心散能夠改善Aβ對(duì)突觸前膜遞質(zhì)釋放效率的抑制。因此我們進(jìn)行了Western-blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Aβ組小鼠海馬p-SYN1表達(dá)降低，且p-SYN1/SYN1比值明顯下降，說明Aβ降低了突觸前膜SYN1的磷酸化水平，這與前人研究結(jié)果不一致，可能與在體實(shí)驗(yàn)的影響因素較復(fù)雜有關(guān)[25]。而給予開心散灌胃的小鼠海馬p-SYN1表達(dá)增加，且p-SYN1/SYN1比值升高，說明開心散能夠增加SYN1的磷酸化水平，逆轉(zhuǎn)Aβ誘發(fā)的p-SYN1/SYN1比值下降，提示開心散可能通過促進(jìn)SYN1磷酸化，增加遞質(zhì)釋放，從而減輕Aβ所致的突觸可塑性抑制。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Aβ/KXS組小鼠海馬SYN1表達(dá)水平較Aβ組減少，這可能與開心散可以降低Aβ引發(fā)突觸前膜遞質(zhì)釋放紊亂帶來的損害有關(guān)[25]。

綜上，開心散通過增加SYN1磷酸化蛋白表達(dá)進(jìn)而改善Aβ誘發(fā)的突觸可塑性抑制，可能是開心散改善Aβ所致小鼠記憶障礙的機(jī)制之一。然而，突觸前膜含有多種涉及到突觸傳遞的因子，機(jī)制也較為復(fù)雜，本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)突觸前膜的SYN1及其磷酸化參與開心散改善Aβ所致突觸可塑性抑制，但詳細(xì)的突觸前膜機(jī)制有待進(jìn)一步研究。