新疆哈薩克族CETP基因多態(tài)性與血脂及高脂血癥中醫(yī)證型的關(guān)系

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血脂研究已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注，高血脂危害著人們的健康，是引起冠心病、高血壓、腦梗死等心腦血管疾病的重要原因[1]。血脂異常是指人體內(nèi)多余的脂蛋白在血管內(nèi)堆積的過程，高脂血癥是指高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低，以及三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的異常增高，其中的任何一項或幾項異常均可以被認(rèn)為是血脂異常[2]。血脂異常的患病率在全世界范圍內(nèi)不斷增長，在我國普通成人血脂報告中顯示，新疆哈薩克族人口血脂異?；疾÷蕿?1.8%[3]。血脂異常與冠心病、糖尿病、腦梗死等心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人們的身體健康，血脂異常的形成與多種因素相關(guān)，其中包括運動、飲食、生活習(xí)慣和基因遺傳等因素，其中遺傳因素的作用越來越受到人們的關(guān)注[4]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，5%血脂異常與基因遺傳相關(guān)[5]。本研究探索新疆哈薩克族CETP基因多位點和血脂異常之間關(guān)系，從基因角度探索血脂異常的發(fā)病機制。以期為哈薩克族血脂異常的預(yù)防和治療在基因水平提供一種新的方法，為心血管和腦血管疾病的預(yù)防和治療提供遺傳基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以新疆烏魯木齊市為調(diào)查地點，對哈薩克族聚集區(qū)進(jìn)行采樣，采用隨機整群抽樣的方法收集符合標(biāo)準(zhǔn)的研究對象建立標(biāo)本庫。從前期建立的人群標(biāo)本庫隨機抽取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對象448例(其中高脂血癥病人218例)。在這448例研究對象中，男女比例1.009∶1，男性225例，女性223例，年齡18歲～70歲(51.58±11.37歲)；身高(165.1±7.8) cm；體重(73.78±14.61)kg。該研究為國家自然科學(xué)基金資助的項目(No.81160429)，通過新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會許可。

所有合格研究對象均在入選前給予告知檢查指標(biāo)的詳情和利弊，并簽署知情同意書。選擇同期健康體檢者230名作為健健對照組。

1.2 病例收集 課題組制定《新疆不同民族高脂血癥易感因素的流行病學(xué)調(diào)查研究調(diào)查表》，對性別、年齡、身高、體重指數(shù)(BMI)、腰圍、民族、體重、飲食、運動、吸煙、飲酒和中醫(yī)證候等信息進(jìn)行分析研究。探索易感因素與高脂血癥發(fā)病關(guān)系及與中醫(yī)證型的關(guān)系[6]。西醫(yī)診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2002年版《中國成人血脂異常防治指南》規(guī)定：TC≥6.22 mmol/L，或TG≥2.26 mmol/L，或LDL-C≥4.14 mmol/L，或HDL-C≤1.04 mmol/L；且年齡18歲～70歲的哈薩克族居民[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：心肌梗死、腦梗死、外傷或重大手術(shù)后者；嚴(yán)重的心、肝、腎等重大疾病和免疫系統(tǒng)疾病者。中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)：參照中華人民共和國衛(wèi)生部2002年制定的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》與分型標(biāo)準(zhǔn)[8]，分為肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、痰濁阻遏證、陰虛陽亢證、氣滯血瘀證5型。中醫(yī)證候分型參照《中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》判斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。

1.3 血液標(biāo)本采集 受試者空腹12 h，晨起采集5 mL靜脈未抗凝血，在2 h內(nèi)離心分離血清，送檢驗科檢測，包括血脂七項、空腹血糖(Glu)。采用自動分析生化分析儀完成檢測。另外3 mL血用拘櫞酸鈉抗凝劑(anticoagulant ACD)抗凝，保存在-20℃冰箱中待提取基因組DNA使用[11]。

1.4 基因分型 用人體血液基因組DNA提取DNA(試劑盒由上海來楓生物科技有限公司提供)。采用上海生物公司提供的SNP分型試劑盒，對448個樣本進(jìn)行SNP位點分型。①CETP基因A373P、c.*84G>A突變位點所在區(qū)段先采用PCR擴增。②擴增后的產(chǎn)物經(jīng)核酸酶外切純化后用于后續(xù)連接酶的反應(yīng)[12]。③根據(jù)美國國家生物技術(shù)中心(NCBI )提供的A373P、c.*84G>A(rs1801706，rs5880)[11]。④序列，使用Primer5.0軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計并進(jìn)行比對。引物序列由上海生工工程公司合成，上游及下游引物序列分別為rs1801706F：GGTCGGGATGGGGCTTGTAG和rs1801706R：GGGAGGAGTTGGGAGCCAATr；rs588oF：GAGCCCTGGCTCACAGCAA和rs5880R：TGACCGCCCCCTCTCTTCTC[13]。采用上海天昊生物公司的imLDRTM 多重SNP分型試劑盒對448個樣本進(jìn)行2個SNP位點分型。目標(biāo)SNP位點所在區(qū)段先采用多重PCR反應(yīng)在一個體系中獲得擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)外切核酸酶及蝦堿酶(ExoI/SAP)純化后用于后續(xù)連接酶反應(yīng)的模板[14]。在一個連接反應(yīng)中，每個位點包含兩個5′端等位基因特異探針(其3′末端分別為兩個等位基因特異堿基或序列——對插入缺失多態(tài)而言)以及緊挨其后的一條3′端位點的熒光標(biāo)記的特異探針。連接產(chǎn)物通過ABI3730XL的毛細(xì)管電泳來區(qū)分，原始數(shù)據(jù)文件用GeneMapper4.1軟件(appliedbiosystems)來分析[15]。

2 結(jié) 果

2.1 高脂血癥組與健康對照組間臨床資料比較 兩組間年齡、性別、身高構(gòu)成比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05 )，BMI、腰圍、食用肉制品比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而吸煙、飲酒、運動則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05 )。高脂血癥組較血脂健康組體重更重、腰圍更寬、BMI指數(shù)更高、食用肉制品更多，和飲食偏嗜關(guān)系則不大，與是否運動也無統(tǒng)計學(xué)意義。血脂異常是一個多因素共同作用的結(jié)果，而飲食起到了關(guān)鍵作用。詳見表1。

2.2 新疆哈薩克族c.*84G>A和A373P位點基因型和等位基因頻率 新疆哈薩克族高脂血癥病人rs1801706(A373P)位點，AA、 AG和GG基因型頻率分別為3例(1.4%)、39例(17.9%)和176例(80.7%)，GG基因型最多，AG基因型其次，AA基因型最少，純合子最多，突變純合子最少，A373P位點很少發(fā)生突變，且與高脂血癥的發(fā)生沒有必然聯(lián)系。從等位基因頻率觀察G等位基因占89.7%，但與健康對照組相比變化并不顯著，G等位基因與高脂血癥的發(fā)生發(fā)展并沒有必然的聯(lián)系[17]，表明G等位基因并不是血脂的保護因素或者危險因素。從健康對照組中觀察到AA、AG和GG基因型頻率分別為2例(0.9%)、35例(15.2%)和193例(83.9%)；GG基因型占多數(shù)。高脂血癥組中 A和G的等位基因頻率分別為10.3%和89.7%，健康對照組中A和G的等位基因頻率分別為8.5%和91.5%。高脂血癥與對照組中等位基因之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[18]。

新疆哈薩克族高脂血癥組中rs5880(c.*84G>A)位點CC、CG和GG基因型頻率分別為0例(0.0%)，11例(5.0%)和207例(95.1%)，健康對照組中CC、CG和GG基因型頻率分別為0.0%、7.4%和92.6%；高脂血癥組中C和G的等位基因頻率分別為2.5%和97.5%，健康對照組中C和G的等位基因頻率分別為3.7%和96.3%。c.*84G>A位點基因型與等位基因頻率在高脂血癥組和健康對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義[19]。詳見表2。

表1 高脂血癥組與健康對照組臨床資料比較

表2 兩組c.*84G>A和A373P位點基因型和等位基因頻率分布 例(%)

兩組人群皆符合Hardy-Weinberg平衡定律，基因多態(tài)性哈迪溫伯格平衡檢驗符合人群分布(P>0.05)。新疆哈薩克族高脂血癥病人與健康對照組的CETP基因c.*84G>A、A373P位點基因型和等位基因頻率的分布無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)[20]。

2.3 新疆哈薩克族c.*84G>A和A373P位點基因型與血脂水平的關(guān)系 新疆哈薩克族CETP基因A373P基因型高脂血癥組和對照組間血漿TC、LDL-C差異有統(tǒng)計學(xué)意義。rs1801706位點高脂血癥中G等位基因攜帶者(AG、GG基因型)較非G等位基因攜帶者(AA基因型)有更高的血漿TC(P<0.05)[21]；健康對照組中則無統(tǒng)計意義。rs1801706高脂血癥組G等位基因攜帶者較非G等位基因攜帶者有更高的血漿TC水平(P<0.05 )。

新疆哈薩克族CETP基因rs5880 (c.*84G>A)位點多態(tài)性基因型高脂血癥組和健康對照組之間血漿TC有差異。rs5880位點高脂血癥中G等位基因攜帶者(GG基因型)較G等位基因攜帶者有更高的血漿TC水平(P<0.05)[22]；健康對照組中無統(tǒng)計學(xué)意義。rs5880高脂血癥組GG基因型較CG基因型有更高的血漿TC水平(P<0.05 )。詳見表3。

表3 兩組基因型與血脂水平的關(guān)系(±s) mmol/L

2.4 基因多態(tài)性型與中醫(yī)證型的關(guān)系

2.4.1 新疆哈薩克族高脂血癥中醫(yī)辨證分型 高脂血癥病人共218例，根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》分型標(biāo)準(zhǔn)，共分為肝腎陰虛、脾腎陽虛、陰虛陽亢、痰濁阻遏、氣滯血瘀5型。其中肝腎陰虛證41例(18.8%)，脾腎陽虛證35例(16.1%)，痰濁阻遏證87例(39.9%)，陰虛陽亢證有18例(8.3%)，氣滯血瘀證37例(17.0%)。

2.4.2 新疆哈薩克族高脂血癥病人CETP表型及等位基因分布 218例高脂血癥病人中(A373P)位點共檢出純合子(GG)、雜合子(AG)和突變純合子(AA)3種基因型，rs1801706基因型以GG純合子占大多數(shù)，共176例(80.7%)，AA突變純合子最低，僅有3例(1.4%)；等位基因頻率則以G最高，占89.7%。rs5880 (c.*84G>A)位點共檢出純合子(GG)、雜合子(CG)和突變純合子(CC)3種基因型，rs5880 c.*84G>A位點以GG純合子占大多數(shù)，共207例占95.0%，CC突變純合子則沒有檢測出[23]；等位基因頻率則以G最高，占97.5%。

2.5 中醫(yī)證型與CETP基因型比較 rs1801706位點GG基因型中痰濁阻遏證最多，有70例；其次為肝腎陰虛和脾腎陽虛證，分別為36例和28例。AG基因型中痰濁阻遏最多(16例)，其次為氣滯血瘀型11例。AA基因型所有證型都很少，脾腎陽虛2例，痰濁阻遏1例。等位基因頻率A等位基因中痰濁阻遏與氣滯血瘀最多，分別為18例和11例。G等位基因中痰濁阻遏與肝腎陰虛最高，分別為156個和77個。進(jìn)一步統(tǒng)計學(xué)分析表明，在GG、AA、AG基因型構(gòu)成比中存在差異，痰濁阻遏高于肝腎陰虛，肝腎陰虛高于脾腎陽虛，脾腎陽虛高于氣滯血瘀，氣滯血瘀高于陰虛陽亢[24]。詳見表4。

2.6 中醫(yī)證型c.*84G>A基因型比較 rs5880位點GG基因型中痰濁阻遏證最多有80例；其次為肝腎陰虛和氣滯血瘀，分別為40例和35例，CG基因型中痰濁阻遏最多7例，其次為氣滯血瘀型有2例。CC基因型則未檢測出來。等位基因頻率G等位基因中痰濁阻遏與肝腎陰虛最多，分別為167個和81個。A等位基因中痰濁阻遏與肝腎陰虛最高，分別為7個和12個。進(jìn)一步統(tǒng)計學(xué)分析表明，在GG、CC、CG基因型構(gòu)成比中存在差異，痰濁阻遏高于肝腎陰虛，肝腎陰虛高于脾腎陽虛，脾腎陽虛高于氣滯血瘀，氣滯血瘀高于陰虛陽亢。新疆哈薩克族高脂血癥病人CETP基因c.*84G>A位點CC基因型未檢測出，說明在c.*84G>A位點中未發(fā)生突變。突變只占少部分，多數(shù)中醫(yī)證型都沒有發(fā)現(xiàn)突變[25]。詳見表5。

表4 A373P基因多態(tài)性與高脂血癥中醫(yī)證型的關(guān)系(n=218) 例(%)

表5 c.*84G>A基因多態(tài)性與高脂血癥中醫(yī)證型的關(guān)系 例(%)

3 討 論

本研究入選的高脂血癥人群和健康對照者之間在身高、性別、運動等一般特征比較無統(tǒng)計學(xué)意義[26]，但是在食用肉制品、腰圍、BMI的比較有統(tǒng)計學(xué)意義，嗜食肥甘、體型過胖是造成哈薩克族血脂異常的主要原因，更是哈薩克族高脂血癥患病率高的一個獨立危險因素，所以改變飲食習(xí)慣對于哈薩克族降低血脂尤為重要[27]。哈薩克族是一個游牧民族，多聚集在一個地方[28]，高脂血癥發(fā)病率越來越高，改變飲食習(xí)慣很重要。

在新疆哈薩克族中CETP基因rs1801706多態(tài)性與血脂異常的發(fā)生密切相關(guān)； 位點rs1801706 與rs5880 G等位基因的頻率對于血脂異常的哈薩克族人口是保護性因素。然而，rs1801706 A等位基因則是風(fēng)險因素。新疆哈薩克族CETP基因rs5880 (c.*84G>A)基因型高脂血癥組和健康對照組之間血漿TC有統(tǒng)計學(xué)意義。rs5880 (c.*84G>A)位點多態(tài)性基因型高脂血癥組和健康對照組之間血漿TC有統(tǒng)計學(xué)意義。rs1801706位點高脂血癥中G等位基因攜帶者(AG、GG基因型)較非G等位基因攜帶者(AA基因型)有更高的血漿TC水平(P<0.05)；健康對照組中則無統(tǒng)計學(xué)意義[29]。rs5880高脂血癥組G等位基因攜帶者較非G等位基因攜帶者(CC基因型)有更高的血漿TC水平(P<0.05 )?；蛲蛔冋忌贁?shù)，有意義的突變更是很少，基因純合子為最多，突變雜合子rs1801706 (A373P)位點中很少，rs5880 (c.*84G>A)則未檢測出有突變。

高脂血癥為中醫(yī)的血中痰濁，中醫(yī)認(rèn)為血濁、血中脂質(zhì)濃度升高是血中痰濁的主要物理基礎(chǔ)[30]。本研究結(jié)果顯示rs1801706位點GG基因型與病人的TC濃度升高有顯著相關(guān)性。由此推測rs1801706位點AA基因型可能與高脂血癥痰濁阻遏證候發(fā)生有密切關(guān)系，有可能是高脂血癥痰濁阻遏證的易感基因之一。所以清淡飲食和適當(dāng)運動將更有利于防治或延緩高脂血癥的發(fā)生和發(fā)展?？梢钥闯鰎s1801706位點GG基因型中痰濁阻遏證最多，其次為肝腎陰虛和脾腎陽虛。所以GG基因型是高脂血癥痰濁阻遏的易感因素。AG基因型中痰濁阻遏最多，其次為氣滯血瘀型。AA基因型與痰濁阻遏的關(guān)系不明顯。AA基因型所有證型都很少，脾腎陽虛2例，痰濁阻遏1例。AA基因是高脂血癥的保護因素[31]。rs5880位點GG基因型中中醫(yī)證型的比例依次為痰濁阻遏證>肝腎陰虛>氣滯血瘀。CC基因型在rs5880位點則未檢測出來。說明在c.*84G>A位點中未發(fā)生突變。突變只占少部分，多數(shù)中醫(yī)證型都沒有發(fā)現(xiàn)突變。等位基因頻率G等位基因中痰濁阻遏為156例，占大多數(shù)，所以G等位基因是痰濁阻遏的易感因素。

在GG、AA、AG基因型構(gòu)成比中存在差異，痰濁阻遏高于肝腎陰虛，肝腎陰虛高于脾腎陽虛，脾腎陽虛高于氣滯血瘀，氣滯血瘀高于陰虛陽亢。高脂血癥中痰濁阻遏的占比較多，這與哈薩克族嗜食牛羊馬肉、飲酒有密切的關(guān)系，肉能生濕生痰，酒能助濕，造就了哈薩克族多以痰濁體質(zhì)為主，痰濁體質(zhì)者易患高脂血癥，是高脂血癥的易感因素，從基因?qū)用娣治隹矗?GG基因型與血脂異常有相關(guān)性，所以GG基因型是高脂血癥易感因素，開展此項研究治療哈薩克族高脂血癥病人，尤其是中醫(yī)治療高脂血癥時應(yīng)重視基因型，為哈薩克族預(yù)防血脂異常，防治心腦血管疾病提供了指導(dǎo)。