三種天然防腐劑對(duì)五種常見(jiàn)微生物抑菌作用的研究

馮林慧，李迎秋，張?chǎng)?/p>

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

食品加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)生的食品腐敗變質(zhì)是目前食品工業(yè)面臨的主要問(wèn)題之一。化學(xué)防腐劑廣泛地應(yīng)用在食品工業(yè)中，從而有效地控制了食品中腐敗微生物的生長(zhǎng)。近年來(lái)，化學(xué)防腐劑的潛在毒性以及微生物耐藥性的出現(xiàn)，使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注天然防腐劑的開(kāi)發(fā)與研究[1]。天然防腐劑來(lái)源廣泛，普遍存在于植物、動(dòng)物、微生物中。天然防腐劑具有很多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)高等動(dòng)物正常細(xì)胞基本無(wú)毒副作用、水溶性良好、抗菌性好且不易產(chǎn)生耐藥性[2]。

大豆球蛋白堿性多肽(植物來(lái)源)是從豆粕中提取出的一種陽(yáng)離子肽，具有廣譜抑菌性，且對(duì)人體胚胎腎細(xì)胞無(wú)毒性[3,4]。殼聚糖(動(dòng)物來(lái)源)是甲殼素脫乙?；蟮囊环N堿性多糖，來(lái)源豐富，由于其良好的成膜性被應(yīng)用于果蔬保鮮中[5]。乳酸鏈球菌素是(微生物來(lái)源)由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的含34個(gè)氨基酸的一種多肽，是世界上公認(rèn)的無(wú)毒副作用的天然食品防腐劑[6]。本實(shí)驗(yàn)選取李斯特菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉，研究以上3種不同來(lái)源的天然防腐劑的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆球蛋白堿性多肽：實(shí)驗(yàn)室富集所得；殼聚糖：山東濰坊海之源生物有限公司；乳酸鏈球菌素：浙江銀象生物工程有限公司；其余試劑：均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基及菌種

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(用于李斯特菌培養(yǎng))、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(用于金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌培養(yǎng))、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(用于白色假絲酵母、黑曲霉培養(yǎng))。李斯特菌ATCC 19115、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、綠膿桿菌ATCC 9027、白色假絲酵母ATCC 10231、黑曲霉菌ATCC 16404：齊魯工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

1.2.1.1 細(xì)菌和酵母菌菌懸液的制備

將細(xì)菌分別接種于腦心浸液肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h；將酵母菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，置于37 ℃下培養(yǎng)60 h。然后挑取細(xì)菌和酵母菌菌落分別接種于腦心浸液肉湯液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，在37 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，平板計(jì)數(shù)測(cè)定菌體濃度，將培養(yǎng)液稀釋成菌體濃度為107cfu/mL的菌懸液，4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 霉菌孢子懸液的制備

將黑曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)60 h。然后用20 mL無(wú)菌水洗下孢子，渦旋振蕩，調(diào)整孢子含量為107個(gè)/mL的菌懸液，4 ℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 防腐劑母液的配制

大豆球蛋白堿性多肽、殼聚糖、乳酸鏈球菌素用無(wú)菌水配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的溶液，無(wú)菌過(guò)濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

1.2.3.1 細(xì)菌和酵母菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

將大豆球蛋白堿性多肽、殼聚糖、乳酸鏈球菌素的母液分別加入到細(xì)菌和酵母菌的菌懸液中，使3種防腐劑的終濃度為0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，于37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水代替防腐劑作為陽(yáng)性對(duì)照，用液體培養(yǎng)基代替菌液作為陰性對(duì)照，空白參比為陰性對(duì)照，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.2.3.2 霉菌最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定[7]

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和3種防腐劑均勻混合，使混合培養(yǎng)基中防腐劑的最終濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL，待溫度降至50 ℃左右后，將混合培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平板中，冷卻。分別取100 μL孢子懸浮液注入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃涂布棒涂布均勻，放置5 min，然后放入培養(yǎng)箱中，于28 ℃下倒置培養(yǎng)7天。用無(wú)菌水代替防腐劑作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，觀察其生長(zhǎng)狀況，以肉眼看不到菌絲生長(zhǎng)的最小防腐劑濃度作為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆球蛋白堿性多肽最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

大豆球蛋白堿性多肽對(duì)細(xì)菌和酵母菌的最小抑菌濃度見(jiàn)表1。

表1 大豆球蛋白堿性多肽對(duì)細(xì)菌和酵母菌的最小抑菌濃度

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)，“+”表示有菌生長(zhǎng)。

大豆球蛋白堿性多肽對(duì)霉菌的最小抑菌濃度見(jiàn)圖1。

圖1 大豆球蛋白堿性多肽對(duì)霉菌的最小抑菌濃度

注：a為陽(yáng)性對(duì)照，b為0.5 mg/mL，c為1.0 mg/mL，d為1.5 mg/mL，e為2.0 mg/mL，f為2.5 mg/mL。

本文選取的5種菌中，李斯特菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，綠膿桿菌則為革蘭氏陰性菌，白色假絲酵母為酵母菌，黑曲霉為霉菌。由表1和圖1可知，大豆球蛋白堿性多肽對(duì)李斯特菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌3種細(xì)菌的最小抑菌濃度依次增大，分別為0.125，0.25，0.5 mg/mL；對(duì)白色假絲酵母的最小抑菌濃度為1.0 mg/mL，對(duì)黑曲霉的最小抑菌濃度為1.5 mg/mL。由此說(shuō)明，大豆球蛋白堿性多肽對(duì)細(xì)菌有良好的抑菌作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用尤其明顯。這可能是由于綠膿桿菌作為革蘭氏陰性菌具有脂多糖的雙層膜比革蘭氏陽(yáng)性菌的單層膜對(duì)大豆球蛋白堿性多肽的耐受性好[8]。大豆球蛋白堿性多肽對(duì)酵母菌的抑制作用不明顯，對(duì)霉菌的抑菌效果尤其微弱。

2.2 殼聚糖最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

殼聚糖對(duì)細(xì)菌和酵母菌的最小抑菌濃度見(jiàn)表2。

表2 殼聚糖對(duì)細(xì)菌和酵母菌的最小抑菌濃度

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)，“+”表示有菌生長(zhǎng)。

殼聚糖對(duì)霉菌的最小抑菌濃度見(jiàn)圖2。

圖2 殼聚糖對(duì)霉菌的最小抑菌濃度

注：a為陽(yáng)性對(duì)照，b為0.5 mg/mL，c為1.0 mg/mL，d為1.5 mg/mL，e為2.0 mg/mL，f為2.5 mg/mL。

由表2和圖2可知，殼聚糖對(duì)李斯特菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對(duì)綠膿桿菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL，對(duì)白色假絲酵母的最小抑菌濃度為2.0 mg/mL，對(duì)黑曲霉的最小抑菌濃度為2.0 mg/mL。殼聚糖對(duì)于金黃色的葡萄球菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他4種菌，對(duì)于酵母菌和霉菌的抑菌效果最差。

2.3 乳酸鏈球菌素最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

乳酸鏈球菌素對(duì)細(xì)菌和酵母菌的最小抑菌濃度見(jiàn)表3。

表3 乳酸鏈球菌素對(duì)細(xì)菌和酵母菌的最小抑菌濃度

注：“-”表示無(wú)菌生長(zhǎng)，“+”表示有菌生長(zhǎng)。

乳酸鏈球菌素對(duì)霉菌的最小抑菌濃度見(jiàn)圖3。

圖3 乳酸鏈球菌素對(duì)霉菌的最小抑菌濃度

注：a為陽(yáng)性對(duì)照，b為0.5 mg/mL，c為1.0 mg/mL，d為1.5 mg/mL，e為2.0 mg/mL，f為2.5 mg/mL。

由表3可知，乳酸鏈球菌素對(duì)李斯特菌和白色假絲酵母的最小抑菌濃度均為0.5 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25 mg/mL，對(duì)綠膿桿菌的最小抑菌濃度為1.5 mg/mL。乳酸鏈球菌素同樣對(duì)于金黃色葡萄球菌有非常好的抑制性，對(duì)于李斯特菌和白色假絲酵母的抑菌能力相對(duì)較差。綠膿桿菌的細(xì)胞壁組成致密，可以將分子質(zhì)量為3500 D的乳酸鏈球菌素阻擋在胞外，因而乳酸鏈球菌素對(duì)綠膿桿菌的抑菌效果微乎其微[9]。由圖3可知，乳酸鏈球菌素對(duì)黑曲霉無(wú)抑菌效果，這與張旋等[10]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆球蛋白堿性多肽、殼聚糖、乳酸鏈球菌素對(duì)于金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度均為0.25 mg/mL，說(shuō)明3種天然防腐劑對(duì)于金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑菌作用。大豆球蛋白堿性多肽對(duì)李斯特菌的抑制效果最佳，最小抑菌濃度為0.125 mg/mL；其他2種防腐劑對(duì)李斯特菌的抑制效果稍差，最小抑菌濃度都是0.5 mg/mL。大豆球蛋白堿性多肽和殼聚糖對(duì)綠膿桿菌的最小抑菌濃度均為0.5 mg/mL，對(duì)白色假絲酵母的最小抑菌濃度分別為1，2 mg/mL，對(duì)黑曲霉的最小抑菌濃度分別為1.5，2.0 mg/mL。乳酸鏈球菌素與其他2種防腐劑相比，對(duì)黑曲霉沒(méi)有抑菌效果；對(duì)綠膿桿菌的抑制效果最不理想，最小抑菌濃度為1.5 mg/mL；而對(duì)于白色假絲酵母的抑菌性最好，最小抑菌濃度為0.5 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)證明了3種天然防腐劑具有良好的抑菌效果，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)單一防腐劑使用的局限性，因此天然防腐劑的復(fù)合使用將是食品工業(yè)中一大熱點(diǎn)。