實(shí)驗(yàn)性鼻竇炎嗅黏膜形態(tài)學(xué)與ATP酶變化的研究

王 斌，李 勇， 曹曉林， 金衛(wèi)東， 劉 鋒

(1. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 杭州 310006；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200433)

引起人類嗅覺障礙的病因大致包括鼻腔、氣道的機(jī)械性阻塞、損傷，細(xì)菌、病毒感染，營(yíng)養(yǎng)及代謝因素，醫(yī)源性及內(nèi)分泌性因素等。研究發(fā)現(xiàn)[1]，上呼吸道的感染、鼻腔炎和鼻竇炎性疾病是引發(fā)功能嗅覺障礙的最常見原因。鼻-鼻竇炎經(jīng)常反復(fù)可引起部分患者嗅覺減退或喪失。何建平等[2]通過急性鼻-鼻竇炎致嗅覺障礙大鼠模型觀察炎癥不同時(shí)期嗅黏膜微結(jié)構(gòu)的變化情況，顯示嗅黏膜纖毛-嗅神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能受損可導(dǎo)致嗅覺障礙。王彤等[3]研究發(fā)現(xiàn)，部分鼻-鼻竇炎性疾病患者通過手術(shù)重建鼻腔的生理功能，可改善和恢復(fù)鼻腔的通氣、鼻竇黏膜的形態(tài)和生理功能。周兵等[4]研究發(fā)現(xiàn)，行手術(shù)治療的56例兒童慢性鼻竇炎患者中，60.7%的患者嗅功能改善或恢復(fù)。ATP酶參與維系纖毛正常功能的動(dòng)力和維持嗅覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的離子電勢(shì)能狀態(tài)。本研究探討新西蘭大白兔鼻竇炎模型中，嗅黏膜形態(tài)學(xué)及嗅黏膜中Na+-K+-ATP酶表達(dá)的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用新西蘭大白兔50只，雄性，體重2.5～3.5 kg，排除鼻腔和上呼吸道疾患，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，使用許可證號(hào)： SYXK(浙)2018-0012。以動(dòng)物每側(cè)鼻竇為一個(gè)單位隨機(jī)分為三組，正常對(duì)照組20側(cè)鼻竇，不予任何處理；鼻竇炎組和手術(shù)處理組各40側(cè)鼻竇， 建立鼻竇炎動(dòng)物模型。手術(shù)處理組在建模4周時(shí)，在鼻內(nèi)鏡引導(dǎo)下，適當(dāng)擴(kuò)大上頜竇竇口；術(shù)后予以1%呋喃西林滴鼻液滴鼻，1天3次，每側(cè)3滴/次，共用7天。

1.2 鼻竇炎動(dòng)物模型的制備[5]鼻竇炎組和手術(shù)處理組兔子分別稱重、固定，20%烏拉坦按5 mL/kg劑量靜脈注射。麻醉成功后，常規(guī)術(shù)區(qū)準(zhǔn)備消毒鋪巾，鼻背旁約1 cm處，鼻內(nèi)鏡引導(dǎo)下，于上頜竇前壁開窗，直徑約3 mm，取周圍組織將竇口完全封閉，采用可吸收縫線縫合切口。將標(biāo)準(zhǔn)肺炎鏈球菌制成濃度為1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏呐囵B(yǎng)菌，培養(yǎng)液為0.45%氯化鈉溶液。術(shù)后第二天，將1 mL肺炎鏈球菌液經(jīng)上頜竇開窗處注入竇腔內(nèi)，術(shù)后切口處涂紅霉素軟膏5 d。

1.3 鼻竇炎動(dòng)物模型的鑒定 制模2周，切開上頜竇前壁，內(nèi)窺鏡下觀察竇腔內(nèi)黏膜有不同程度的充血、腫脹，竇口封閉完好，分泌物細(xì)菌培養(yǎng)為肺炎鏈球菌陽(yáng)性；制模4周， CT影像學(xué)檢查見鼻竇黏膜增厚，竇腔密度增高為建模成功。

1.4 嗅黏膜常規(guī)病理檢查 全麻、斷頭處死動(dòng)物，自鼻背部中線縱行切開，暴露鼻腔，取嗅區(qū)黏膜于福爾馬林液中固定，行HE染色后進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。

1.5 嗅黏膜掃描電鏡觀察 取嗅區(qū)黏膜于4%多聚甲醛固定4 h以上后，用0.1 mmol/L PBS漂洗3次，每次10 min。再用1%的鋨酸(用0.2 mmol/L PBS配置)固定2 h后，0.1 mmol/L PBS漂洗3次，每次10 min。系列乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)各15 min脫水，標(biāo)本臨界點(diǎn)干燥(日立HCP-2型)，用醋酸異戊酯過渡15 min，CO2臨界點(diǎn)干燥3 h以上，最后離子鍍膜(EIKO.IB-5)10 min，采用日立S-520掃描電鏡觀察。

1.6 嗅黏膜透射電鏡觀察 取嗅區(qū)黏膜用0.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液固定4 h后微波5 s。采用0.1mol/L二甲砷酸鈉洗液漂洗4 h或過夜。用1%鋨酸固定，酒精逐級(jí)脫水后采用EMbed 812包埋試劑盒包埋，采用德國(guó)Leica EM UC6超薄切片機(jī)超薄切片，鈾鉛雙重染色后用H-800透射電鏡(日本日立公司)觀察。

1.7 嗅黏膜Na+-K+-ATP酶透射電鏡觀察 采用細(xì)胞化學(xué)方法定位和半定量觀察透射電鏡下嗅黏膜纖毛中的ATP酶變化。取嗅區(qū)黏膜用0.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合固定液固定25 min后微波5 s。采用0.1 mol/L二甲砷酸鈉洗液漂洗4 h后，用0.2 mol/L Tris(pH 9.0)洗3次，每次30 min。用去底物的培養(yǎng)液(0.2 mol/L Tris 10 mL，0.2 mol/L氯化鍶 2 mL，0.2 mol/L氯化鉀 1 mL，0.05 mol/L氯化鎂4 mL，對(duì)硝基苯磷酸鈉34 mg，雙蒸水3 mL ，pH 9.0)37 ℃預(yù)孵育30 min。蒸餾水洗2次后，采用0.05 mol/L Tris洗30 min。蒸餾水洗2次后，2%硝酸鉛孵育15 min。蒸餾水洗3次后，4%多聚甲醛固定2 h。用0.2 mol/L Tris漂洗后，1%鋨酸固定、脫水、采用Epome812包埋試劑盒包埋，采用德國(guó)Leica EM UC6超薄切片機(jī)切片，鈾鉛雙重染色后用H-800透射電鏡(日本日立公司)觀察。

1.8 嗅黏膜ATP酶含量檢測(cè) 取嗅區(qū)黏膜用生理鹽水漂洗3遍，拭干，稱重。剪碎后加適量預(yù)冷生理鹽水于玻璃勻漿管中勻漿， 4000 r/min 離心10 min，取上清100 μL。采用ATP酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行ATP酶測(cè)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下嗅黏膜形態(tài)學(xué)病理變化 200倍光學(xué)顯微鏡下見正常對(duì)照組的嗅黏膜：游離緣為纖毛，上皮層由支持細(xì)胞、嗅感受神經(jīng)元和基底細(xì)胞構(gòu)成。支持細(xì)胞多呈單排排列，其核多為橢圓形狀；嗅感受神經(jīng)元是梭形雙極細(xì)胞，核多呈橢圓形、梭形；基底細(xì)胞形狀多形，可見多種形態(tài)的胞核，見封三圖1A。鼻竇炎組建模4周的嗅黏膜：纖毛融合、脫落進(jìn)一步加重，上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，但基底細(xì)胞層完整。淋巴、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，嗅神經(jīng)元凋亡，固有層腺體減少，見封三圖1B。鼻竇炎組建模8周的嗅黏膜：纖毛完全脫落，上皮細(xì)胞僅?；准?xì)胞層。淋巴、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，固有層腺體被進(jìn)一步破壞，見封三圖1C。手術(shù)處理組術(shù)后8周的嗅黏膜：纖毛再生已接近正常，上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)也趨正常，固有層腺體再生明顯，纖維組織減少，見封三圖1D。

2.2 掃描電鏡下嗅黏膜形態(tài)學(xué)變化 正常嗅黏膜：黏膜上皮完整連續(xù)，纖毛排列整齊、致密，粗細(xì)均勻，長(zhǎng)短一致，見封三圖2A。鼻竇炎組建模8周的嗅黏膜：部分纖毛上皮細(xì)胞剝脫、壞死，細(xì)胞間隙增寬，纖毛完全脫落，鱗狀上皮化生，見封三圖2B。

2.3 透射電鏡下嗅黏膜形態(tài)學(xué)變化 正常對(duì)照組嗅上皮縱切面可見排列整齊的上皮細(xì)胞、表面的嗅纖毛、膨大的嗅囊，游離緣尚可見支持細(xì)胞的微絨毛；細(xì)胞內(nèi)可見大量的各種細(xì)胞器，見封三圖3A；橫切面微管排列規(guī)整，成典型的“9+2”結(jié)構(gòu)，見封三圖3B；Na+-K+-ATP酶透射電鏡下，沿細(xì)胞膜分布著大量Na+-K+-ATP顆粒，核膜處顆粒不明顯，見封三圖3C；但部分分泌細(xì)胞核膜處可見大量黑色顆粒沉積。鼻竇炎組嗅黏膜細(xì)胞表面嗅纖毛大量脫落，有短纖毛出現(xiàn)；部分支持細(xì)胞微絨毛消失，電子致密的囊泡明顯減少，出現(xiàn)大量的空泡，見封三圖3D；Na+-K+-ATP酶透射電鏡下，細(xì)胞表面嗅纖毛無(wú)黑色顆粒沉積，細(xì)胞內(nèi)線粒體減少、核膜處見黑色顆粒沉積，見封三圖3E。手術(shù)處理組術(shù)后8周的嗅黏膜上皮細(xì)胞縱切面嗅纖毛及微絨毛增加，胞漿內(nèi)線粒體增加，空泡減少，見封三圖3F；橫切面纖毛及微絨毛增加，纖毛排列整齊，粗細(xì)均勻，見封三圖3G；Na+-K+-ATP酶透射電鏡下，沿細(xì)胞膜分布著大量Na+-K+-ATP顆粒，見封三圖3H。

2.4 嗅黏膜ATP酶含量 手術(shù)處理組的ATP酶含量(0.229±0.100 μmolPi/mg)與鼻竇炎組(0.124±0.033 μmolPi/mg)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.884,P=0.006)；正常對(duì)照組的ATP酶含量(0.248±0.082 μmolPi/mg)與手術(shù)處理組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.306,P=0.642)。

3 討論

楊麗輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，隨著鼻竇炎癥的發(fā)展，呼吸上皮范圍擴(kuò)大、嗅上皮的面積減少，進(jìn)而導(dǎo)致嗅覺下降；嗅上皮嗅細(xì)胞減少、嗅上皮萎縮是嗅覺障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)。Mulvaney等[7]研究測(cè)量兔嗅上皮面積約為7.27～9.3 cm2，每平方厘米嗅上皮大約有1千萬(wàn)個(gè)嗅神經(jīng)元。嗅神經(jīng)元是雙極細(xì)胞，具有再生能力，修復(fù)周期約30 d。嗅覺受體為G蛋白偶聯(lián)受體[8-10]，嗅覺信號(hào)與嗅覺受體結(jié)合后，經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)化和信號(hào)傳遞，產(chǎn)生動(dòng)作電位并傳導(dǎo)到大腦嗅覺中樞；靜息時(shí)流動(dòng)的離子泵回原位，恢復(fù)嗅覺受體的膜電位水平，這些過程需要Na+-K+-ATP酶參與[11-12]。ATP酶活力的大小是細(xì)胞能量代謝及功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)[13]。

本研究結(jié)果顯示，炎癥狀態(tài)的嗅黏膜表面嗅纖毛大量脫落，細(xì)胞內(nèi)線粒體減少、腫脹、出現(xiàn)空泡，嗅黏膜中Na+-K+-ATP酶的含量明顯減少；隨著炎癥的改善，嗅粘膜Na+-K+-ATP酶含量恢復(fù)接近正常對(duì)照。原因可能為：①炎癥狀態(tài)時(shí)，鼻黏膜腫脹、分泌物潴留使氣流難以到達(dá)嗅區(qū)，同時(shí)嗅纖毛脫落、嗅覺受體減少而導(dǎo)致嗅覺減退甚至喪失；②ATP酶表達(dá)減少、細(xì)胞內(nèi)線粒體減少而使產(chǎn)生的ATP下降，從而不能充分提供嗅覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的能量，同時(shí)導(dǎo)致利用ATP生產(chǎn)的第二信使cAMP減少，激活離子門控通道的能力下降，影響動(dòng)作電位的形成，導(dǎo)致嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)而引起嗅覺障礙；③Na+-K+-ATP酶減少影響靜息時(shí)流動(dòng)的離子泵回原位，進(jìn)而阻礙動(dòng)作電位的產(chǎn)生，導(dǎo)致嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)障礙。提示炎癥狀態(tài)使嗅粘膜中Na+-K+-ATP酶的表達(dá)降低可能是導(dǎo)致嗅覺障礙發(fā)生的原因之一，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

內(nèi)窺鏡鼻竇手術(shù)術(shù)后嗅覺的恢復(fù)主要得益于再生的嗅上皮和氣流動(dòng)力學(xué)的改善。但術(shù)后嗅覺恢復(fù)程度與嗅上皮病變程度成正相關(guān)，嗅細(xì)胞的數(shù)量減少越明顯，嗅覺障礙治療的預(yù)后越差[14]。Downey等[15]評(píng)價(jià)了50例與鼻竇炎有關(guān)的嗅覺障礙患者行鼻內(nèi)鏡手術(shù)后嗅覺的變化，結(jié)果顯示，手術(shù)治療后52%患者的嗅覺獲得了有意義的改善，且改善率隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。Lund等[16]評(píng)價(jià)了200例慢性鼻竇炎患者行鼻竇內(nèi)窺鏡手術(shù)后的效果，發(fā)現(xiàn)術(shù)后主觀嗅閾、客觀評(píng)分和視覺分類值均明顯改善。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[17-19]也有慢性鼻竇炎患者經(jīng)鼻內(nèi)鏡手術(shù)后嗅覺恢復(fù)存在差異的報(bào)道，可能與鼻竇炎的分型、病史長(zhǎng)短、嗅黏膜損傷程度、手術(shù)方式及個(gè)體差異等有關(guān)。另本研究結(jié)果提示，鼻竇炎引起嗅覺下降的患者盡早手術(shù)有利于嗅黏膜及嗅覺的恢復(fù)。