建立體外血腦脊液屏障模型方法學研究

張海威 張丹參 蘇曉梅 趙凱燕 武春陽 張 力

1. 河北北方學院藥學系，張家口，075000，中國

2. 河北科技大學，石家莊，050000，中國

血腦脊液屏障是保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一層復雜的屏障系統(tǒng)，其有效的將血液和腦組織分離開來，通過多種細胞組成的“神經(jīng)血管單元”，調(diào)節(jié)著營養(yǎng)物質(zhì)滲透入腦而減少有毒有害物質(zhì)的吸收，發(fā)揮著保護神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的重要作用［1］。血腦脊液屏障在體研究因高成本、費時、操作繁瑣，受多種因素干擾等影響試驗進展，因而研究人員更傾向體外模型研究，在神經(jīng)治療藥物高通量篩選實驗、藥物跨血腦脊液屏障轉(zhuǎn)運研究等方面展現(xiàn)出高效低耗的優(yōu)勢。因此，建立相對簡單可靠、重復性好、接近在體狀態(tài)的體外血腦脊液屏障模型，對研究藥物對血腦脊液屏障的影響及藥物轉(zhuǎn)運機制方面提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康成年 Sprague Dawley（SD）大鼠，SPF級，體質(zhì)量（250～300） g，♀♂比例為 2∶1，合格證號SCXK（京）2014-0004，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)于河北北方學院藥學系動物屏障室，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，雌雄合籠配種，見陰栓后異籠飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及材料

HBSS平衡鹽液、Hibermate-E、DMEM/F12、胎牛血清、0.5% Trypsin-EDTA，均購自美國Gibco公司；ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、內(nèi)皮細胞生長添加劑ECGS、青霉素/鏈霉素溶液，均購自美國Sciencell公司；Accutase、Albumin from bovine serum，均購自Sigma公司；膠原酶/分解酶，購自美國Roche公司；Ⅱ型膠原酶、D-NaseⅠ酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）活性測定試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒，均購自北京索萊寶生物科技有限公司；GFAP多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司；Ⅷ-R Ag多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒，均購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司；FITC標記的羊抗兔IgG、Cy3標記的羊抗兔IgG、DAPI染色液，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Transwell小室、T25細胞培養(yǎng)瓶，購自美國Corning公司；Millicell-ERS-2細胞電阻儀，購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠星形膠質(zhì)細胞（astrocyte，As）的原代培養(yǎng)

取1～2日齡新生SD大鼠4只處死，75%酒精消毒浸泡消毒后，在無菌條件下斷頭取雙側(cè)大腦，置于盛有冰Hibermate-E液的培養(yǎng)皿中，在冰上仔細去除腦膜及大血管，分離兩側(cè)大腦皮質(zhì)。將皮質(zhì)剪碎成糜狀后置于15 mL離心管中，用HBSS液清洗三次，后加入消化液（a ccutase）+0.1% DNAase消化，37℃水浴鍋孵育 15 min，每5 min晃一次。As完全培養(yǎng)基+0.1% DNAase 1 mL吹打10～15次，靜置3 min，取上清液過200目細胞篩后，將濾液接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5 h后，通過差速貼壁法處理，吸出細胞懸液轉(zhuǎn)接種于多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至單層融合時，將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫搖床上180 r·min-1震蕩4 h，收集貼壁細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代，之后用As完全培養(yǎng)基，2～3 d換液一次。

1.2.2 SD大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）的原代培養(yǎng)

取10只新生7日齡左右的SD大鼠，用75%乙醇消毒。在無菌條件下迅速取出全腦，并將其置于預冷的Hibermate-E液的培養(yǎng)皿中，仔細剝離間腦和小腦，保留大腦灰質(zhì)部分。將灰質(zhì)部分全部剪碎至1 mm3大小，并移至離心管中，加入0.1%Ⅱ型膠原酶（含30 U·mL-1，DNase Ⅰ）吹打混勻后，置于37℃水浴中消化40 min，之后加入0.1%膠原酶/分散酶（含20 U·mL-1，DNaseⅠ）在37℃水浴中共同消化40 min，終止消化，4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入無血清的ECM培養(yǎng)基混勻后過100目細胞篩，收集濾液4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清液，加入兩倍體積的 20% BSA 液重新混勻后，4 ℃，1 000 r·min-1離心20 min。棄去中上層組織及大血管，保留底部沉淀，再加入1 mL無血清的ECM培養(yǎng)基輕柔吹打洗滌，4 ℃，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，加入兩倍體積的20%BSA 液重新混勻后，4 ℃，1 000 r·min-1離心 20 min。棄上清液，獲得底部黃白色腦微血管段，加入ECM完全培養(yǎng)基混懸后，接種于鼠尾膠原預包被的25 mL培養(yǎng)瓶中，加入濃度為4 mg·L-1的嘌呤霉素，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后換為不含嘌呤霉素的ECM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液一次。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察

將培養(yǎng)有BMECs和As的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，觀察細胞貼壁、形態(tài)及生長狀況。

1.2.4 免疫熒光化學染色

取出已固定好的BMECs和As爬片；PBS漂洗5 min×3次；加入TritonX-100透化液室溫處理10 min；PBS漂洗5 min×3次；山羊血清室溫封閉30 min；PBS漂洗5 min×3次；加入Ⅷ因子相關(guān)抗原的單克隆抗體（1∶200）；兔抗鼠 GFAP（1∶100）；4 ℃冰箱中孵育過夜；PBS漂洗5 min×3次；加入FITC標記的羊抗兔熒光二抗以及Cy3標記的羊抗兔熒光二抗，避光，室溫孵育1 h；PBS漂洗5 min×3次；加入DAPI工作液，避光，室溫孵育15 min；PBS漂洗5 min×3次；置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 體外模型的建立

取傳代的As，用含20%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后，將細胞密度調(diào)整至2×105·mL-1，接種于Transwell小室的反面?zhèn)?，置?7℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，待As基本貼壁后將Transwell小室放入12孔板中加入As完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察As融合生長至70%左右時，在Transwell小室的正面?zhèn)冉臃NBMECs。用ECM完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調(diào)整至 2.5×105·mL-1，接種于 Transwell小室的正面?zhèn)?，置?7 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液一次，直至兩種細胞分別在小室兩側(cè)融合生長。

1.2.6 TEER值測定

實驗分組為共培養(yǎng)組、單獨BMECs培養(yǎng)組和空白對照組，在接種 BMECs后的 1、3、5、7、9、11、13、15 d進行TEER值得測量。TEER值為各小室的TEER平均值減去空白對照組TEER平均值，再乘以小室的膜面積。

1.2.7 液面試漏實驗

待共培養(yǎng)組TEER值檢測保持穩(wěn)定后，于Transwell小室內(nèi)外側(cè)添加細胞培養(yǎng)基，使內(nèi)側(cè)與外側(cè)培養(yǎng)基的液面差≥0.5 cm，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后觀測液面差是否發(fā)生變化，如果細胞已形成致密的屏障，Transwell小室內(nèi)外側(cè)的液面仍保持明顯差距（液面差浮動≤0.1 cm）。

1.2.8 特征性酶檢測

γ-GT檢測：將單獨BMECs培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組Transwell小室的細胞裂解，取上清液備用。按照γ-GT檢測試劑盒要 求，對標準品孔和樣本孔進行檢測，繪制標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各組上清液中γ-GT的量，比較差異。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測：分別提取單獨BMECs培養(yǎng)組、共培養(yǎng)組Transwell小室內(nèi)側(cè)的BMECs的上清蛋白液。按照ALP測定試劑盒說明書中要求步驟，用酶標儀測定樣本蛋白與標準品的吸光度（absorbance，A）值，通過求得標準曲線方程，計算每組ALP活力值，比較差異。

1.2.9 Na-FLU通透性實驗

在共培養(yǎng)中BMECs融合生長并且電阻值保持在恒定后，吸出完全培養(yǎng)基，用HBSS液將Transwell小室內(nèi)外清洗兩遍，用移液管將上室的DMEM/F12替換為0.5 mL濃度為100 μg·mL-1熒光素鈉溶液，下室加入1.5 mL空白DMEM/F12培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱中進行實驗。分別在 15、30、45、60、75、90、105、120 min 時間點從下室吸取100 μL培養(yǎng)基，并立即補充相同體積的DMEM/F12培養(yǎng)基，用多功能酶標儀測定熒光素鈉的光密度值（optical density，OD）。酶標儀測定取得樣本光密度值，利用熒光素鈉標準曲線計算樣本熒光素鈉濃度，依次時間點相應(yīng)濃度累積相加即為該時間點的滲透濃度值。

跨膜滲透系數(shù)（Pe）計算按照先前報道［2］的公式計算。

清除體積與相應(yīng)時間點作坐標曲線圖，實驗分組為共培養(yǎng)組、單獨BMECs培養(yǎng)組和空白對照組，細胞小室和空白小室的曲線分別作直線回歸，斜率分別記作PSt和PSf?？缒B透系數(shù)按照以下公式計算：1·PSe-1=1·PSt-1-1·PSf-1?？缒B透系數(shù) Pe=PSe·S-1，其中 S 為小室膜面積，單位以cm·s-1表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

將原代培養(yǎng)的BMECs和As置于倒置顯微鏡下觀察，BMECs生長區(qū)域沿中心向四周擴大，呈多角形或短梭形，核淡，胞膜明顯，旋渦狀分布，可見典型的鋪路石征象；As呈梭形或不規(guī)則多邊形，部分星形膠質(zhì)細胞長出突足（Fig.1）。

2.2 免疫熒光化學染色

用Ⅷ因子免疫熒光鑒定BMECs，經(jīng)FITC熒光二抗染色后，可見大部分細胞胞漿明顯的綠色熒光，細胞輪廓清晰現(xiàn)出；As經(jīng)GFAP免疫熒光染色后，細胞胞漿及突起發(fā)出明顯的紅色熒光，細胞輪廓清晰現(xiàn)出；細胞核用DAPI藍色熒光染色，細胞核與細胞質(zhì)重疊為陽性細胞，檢測結(jié)果陽性率＞95%（Fig.2）。

2.3 TEER值測定

在Transwell上室種植BMECs后開始檢測共培養(yǎng)模型組和單獨培養(yǎng)BMECs組的TEER值，結(jié)果表明（Fig.3），兩個組的TEER值都隨著時間延長不斷上升，并且BMECs在共培養(yǎng)的d 11基本實現(xiàn)融合生長，TEER值達到穩(wěn)態(tài)。d 15測得共培養(yǎng)模型組TEER值為（378.97±11.38） Ω·cm2，遠高于 BMECs單獨培養(yǎng)組（268.94±25.47） Ω·cm2（P＜0.01）。

2.4 液面試漏實驗

Transwell內(nèi)側(cè)與外側(cè)培養(yǎng)基的液面差≥0.5 cm，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，可見4 h后液面仍保持明顯差距，說明共培養(yǎng)模型組細胞已形成致密的屏障。對照組為未接種細胞小室，可見4 h后液面消失明顯差距（Fig.4）。

Fig.1 The morphology of As and BMECs (×200)

Fig.2 The immunofluorescence images As and BMECs （×200）

Fig.2（continued）

Fig.3 The measurement of TEER across transwel，n=3）

Fig.4 Liquid interview leak test

2.5 特征性酶檢測

γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）檢測：按照γ-GT檢測試劑盒的方法。得出單獨培養(yǎng)BMECs的γ-GT值（13.93±3.08） μmol·min-1·mL-1，共培 養(yǎng) 后的 BMECs的γ-GT 值（30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1，有明顯的差異（P＜0.05）（Fig.5）。

堿性磷酸酶（ALP）檢測：標準OD值為0.356，單獨培養(yǎng)BMECs為0.287，共培養(yǎng)后BMECs為0.425。經(jīng)公式計算，單獨培養(yǎng)BMECs的堿性磷酸酶含量（1.49±0.19）金氏單位·100 mL-1，共培養(yǎng)后 BMECs的堿性磷酸酶含量（2.51±0.88）金氏單位·100 mL-1，有明顯差異（P＜0.01）（Fig.6）。

Fig.5 The detection of γ-GT

Fig.6 The detection of ALP

2.6 Na-FLU通透性實驗

熒光素鈉濃度的標準曲線為y=0.295 1x+0.001 3，x為熒光素鈉濃度，y為吸光度，R2=0.999。根據(jù)熒光素鈉濃度的標準曲線計算出不同時間點Transwell下室中熒光素鈉的濃度，并繪制熒光素鈉濃度-時間的關(guān)系圖（Fig.7）。由圖可知，對熒光素鈉的限制通過能力共培養(yǎng)模型組＞單獨BMECs培養(yǎng)組＞空白對照組。共培養(yǎng)模型組顯示出較強的限制通過能力。

Fig.7 The concentration of fluorescein sodium in the bottom of traswell

Fig.8 The permeability coefficient of fluorescein sodium（

根據(jù)跨膜滲透系數(shù)計算公式得出（Fig.8），2 h后，共培養(yǎng)模型組的熒光素鈉滲透系數(shù)較低，為（1.165±1.91）×106cm·s-1，與單獨 BMECs培養(yǎng)組（2.228±0.85）×106cm·s-1（P＜0.01），有顯著性差異。

3 討論

血腦脊液屏障是免疫系統(tǒng)中重要屏障之一，主要由BMECs、As足突、基膜以及周細胞、神經(jīng)元等多種細胞共同組成的動態(tài)生理結(jié)構(gòu)［3］。其中以BMECs構(gòu)成基礎(chǔ)框架，是血腦脊液屏障中主要發(fā)揮作用的細胞［4］。As作為屏障結(jié)構(gòu)的輔助細胞，可以調(diào)節(jié)BMECs上酶的表達、轉(zhuǎn)運蛋白的功能、增加緊密連接特性、增強細胞旁路的限制性通過。BMECs和As在體外共同培養(yǎng)通過細胞間相互間作用，使模型的特性更接近體內(nèi)血腦脊液屏障，這也是目前國內(nèi)外認可度最高的體外血腦脊液屏障模型建立方法。

為爭取體外血腦脊液屏障更接近在體特征，故選取同種屬SD大鼠的BMECs和As原代培養(yǎng)的方法獲取實驗細胞，原代培養(yǎng)方法可滿足實驗對細胞的大需求量，節(jié)約實驗成本。As在腦皮層中含量豐富，其對生長環(huán)境要求不高，參照張楠［5］海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，并在其基礎(chǔ)上進行改進，獲得簡便、易操作、純度較高的As原代培養(yǎng)方法。BMECs對細胞培養(yǎng)環(huán)境要求較高，需要特定的生長因子維持生長，較As原代培養(yǎng)方法操作復雜、難度較高。通過大量文獻學習［6-7］，以鼠尾膠原包被介質(zhì)使細胞易貼壁生長，采用三種酶（Ⅱ型膠原酶、膠原酶/分散酶、DNA酶Ⅰ型）聯(lián)合消化，使用20% BSA多次離心純化，獲得純度較高的腦微血管碎段。之后加入嘌呤霉素培養(yǎng)48 h，嘌呤霉素為一種蛋白質(zhì)合成抑制劑影響細胞的蛋白合成，由于BMECs上高表達的P-糖蛋白可將嘌呤霉素排出細胞，而其他雜細胞則受到影響無法生長。并使用內(nèi)皮細胞專用ECM培養(yǎng)基，可提供內(nèi)皮細胞生長所需要的微量元素、氨基酸和生長因子等，獲得與文獻報道一致的細胞［8］。由于兩種細胞持續(xù)傳代后，形態(tài)和功能會發(fā)生改變，影響實驗結(jié)果的準確性，故本實驗采用分離純化原代細胞，第一次傳代的細胞進行體外模型建立實驗。

對于體外血腦脊液屏障模型建立情況的評價，本實驗通過四個方面進行評測。TEER值測定表明在接種BMECs后，TEER值不斷升高在培養(yǎng)至第11天后達到穩(wěn)定，并且與對照組比較有顯著性差異；選取TEER值穩(wěn)定的共培養(yǎng)組進行4 h液面試漏實驗，結(jié)果測試即為陽性，說明屏障功能已初步形成。血腦脊液屏障上特征性酶γ-GT與ALP的活性高低，也是檢測模型建立的特征指標，實驗結(jié)果表明共培養(yǎng)模型組的兩種酶活性明顯高于BMECs單獨培養(yǎng)組，與研究報道一致［9］。熒光素鈉是公認的細胞旁路轉(zhuǎn)運標志物，用來評價模型細胞旁路限制性通過功能，進而反應(yīng)轉(zhuǎn)運膜的完整性［10］。Pe是一種不依賴于所測得物質(zhì)濃度的屏障通透性指標，能客觀反應(yīng)化合物和血腦脊液屏障模型間的作用特點，通過對熒光素鈉Pe值的測定，共培養(yǎng)模型組表現(xiàn)出顯著的限制性通過能力，與BMECs單獨培養(yǎng)組比較有顯著差異。

通過實驗證實已建立相對簡單可靠、重復性好、接近在體狀態(tài)的體外血腦脊液屏障模型。為血腦脊液屏障生理結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運機制和功能研究提供實驗?zāi)Ｐ汀?/p>