知黃潰瘍合劑的急性毒性實驗研究

胡曉燕，唐志立，郭廷東

(南充市中心醫(yī)院藥學部，川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)院藥學部，南充 637000)

知黃潰瘍合劑是南充市中心醫(yī)院自制制劑(專利申請?zhí)枺?01710721232.X)，由熟地黃、知母、黃柏、玄參、茯苓、五味子、巴戟天、白及和川牛膝制成，對復發(fā)性口腔潰瘍療效較好。知黃潰瘍合劑原方為該院臨床應用多年的協(xié)定處方。為了進一步評價知黃潰瘍合劑的安全性，對其進行了急性毒性實驗研究，以期為臨床用藥提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 JA1003A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)； JY10001電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；XT2000iV全自動血液分析儀(日本希森美康株式會社);7020全自動生化分析儀(日本HITACHI公司);0508-離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)。

1.2試藥 知黃潰瘍合劑：黑褐色液體，質量濃度為1.5 g·mL-1(相當于原生藥1.5 g)，由南充市中心醫(yī)院提供(批號170323)。谷草轉氨酶(AST)，批號160301;谷丙轉氨酶(ALT)，批號150604;堿性磷酸酶(ALP)，批號160402；總蛋白(TP)，批號160803;白蛋白(ALB)，批號160601;尿素(U-REA)，批號150901;肌酐(CRE)，批號 151004;血糖(GLU)，批號160406；三酰甘油(TG)，批號150902；總膽固醇(CHO)，批號160403。以上試劑均由浙江伊利康生物技術有限公司提供。

1.3動物 KM小鼠，SPF級，體質量為18～22 g，雌雄各半，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK(川)2013-19。

2 實驗方法

2.1實驗環(huán)境 四川省中醫(yī)藥科學院藥理毒理研究所SPF屏障系統(tǒng)[合格證號為SYXK(川)2013-100]。室內溫度為20～22 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h明暗交替照明[1]。自由飲水。標準飼料由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供。

2.2急性毒性實驗 按照半數(shù)急性毒性實驗要求，先進行毒性實驗預實驗預測本品的致死量 (LD50)[1]。取體質量為18～22 g的小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，雌、雄各半，動物適應性飼養(yǎng)3 d，禁食不禁水，16 h 后，分別灌胃給予質量濃度分別為1.5，0.75和0.375 g·mL-1的知黃潰瘍合劑，分別灌胃最大體積(以每克體質量0.04 mL計)，24 h內灌胃2次，相當于3組小鼠公斤體質量日給藥劑量分別為 120，60和30 g。給藥后自由進食和飲水，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠死亡數(shù)。計算出零致死量(Dn)和全致死量(Dm)，進而計算出半數(shù)致死量[2-3]。

2.3最大耐受量的測定 將體質量為18～22 g的小鼠40只，雌雄各半，隨機均分為對照組和知黃潰瘍合劑組。動物在禁食不禁水16 h后，分別灌胃最大體積(以每克體質量0.04 mL計)、最大質量濃度1.5 g·mL-1的知黃潰瘍合劑或等體積蒸餾水。24 h內共給藥2次，觀察并記錄至給藥后14 d小鼠的急性毒性反應情況。

2.4指標測定 觀察小鼠的一般狀態(tài)、行為活動、飲食情況和分泌物等。實驗末期將小鼠麻醉，拔眼珠取血，將所取血液以2 000 r·min-1離心10 min，分離血清，采用日立 7020 型全自動生化分析儀進行生化檢測；處死小鼠，取心、肝、脾、肺和腎稱定濕質量，計算臟器指數(shù)。

3 結果

3.1急性毒性實驗 部分小鼠灌胃知黃潰瘍合劑后有拉稀便癥狀，約5 h后恢復。在灌胃后14 d觀察時間內，小鼠一般狀態(tài)、行為活動和飲食情況等均未見明顯異常，小鼠無死亡；14 d后處死小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺和腎，均未見明顯的病理學變化。因此無法測出知黃潰瘍合劑的半數(shù)致死量，故進行其最大耐受量實驗。

3.2最大耐受量實驗 知黃潰瘍合劑給藥7 d后雌性小鼠體質量增長與對照組比較顯著減慢(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；給藥14 d后恢復正常，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。知黃潰瘍合劑小鼠各生化指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，臟器指數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表1至表4。

表1知黃潰瘍合劑急性毒性反應

Tab.1 Acute toxic reactions of Zhihuang Ulcer Mixture (n=20)

組別劑量/g(以公斤體質量原生藥計)異常反應及死亡情況恢復情況對照組---知黃潰瘍合劑組120.0部分小鼠拉稀便,無死亡藥后約5 h恢復

注：-依次表示未給予知黃潰瘍合劑灌胃、無異常反應及死亡和不需要觀察恢復情況。

由表1可知，灌胃給予知黃潰瘍合劑部分小鼠有拉稀便癥狀，約5 h后恢復，但小鼠無死亡。

表2知黃潰瘍合劑對小鼠體質量的影響

組別劑量/g(以公斤體質量原生藥計)給藥前體質量/g雌性雄性給藥后7 d體質量/g雌性 雄性給藥后14 d體質量/g雌性雄性對照組-18.0±1.017.1±1.128.7±1.231.6±1.532.5±1.741.0±2.0知黃潰瘍合劑組12018.3±0.517.8±1.326.4±2.0??31.3±1.432.7±2.540.2±2.5

注：與對照組比較**P<0.01；-表示未給予知黃潰瘍合劑灌胃。

由表2可知，與對照組比較，知黃潰瘍合劑給藥7 d后雌性小鼠體質量增長顯著減慢(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義；給藥14 d后恢復正常，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

由表3可知，知黃潰瘍合劑小鼠各生化指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表3知黃潰瘍合劑對小鼠生化指標的影響

組別生化指標AST水平/U·L-1ALT水平/U·L-1ALP水平/U·L-1CRE水平/μmol·L-1BUN水平/mmol·L-1CLU水平/mmol·L-1CHO水平/mmol·L-1TP水平/g·L-1ALB水平/g·L-1TG水平/mmol·L-1對照組128.6±40.230.7±18.5156.3±28.037.4±9.39.1±1.22.86±0.752.06±0.2543.7±6.328.8±3.01.14±0.25知黃潰瘍合劑組125.1±48.530.2±20.2160.6±24.648.0±6.98.5±0.92.88±0.912.25±0.4144.4±6.328.7±2.91.10±0.27

注：組間比較P>0.05。

表4知黃潰瘍合劑對臟器指數(shù)的影響

組別劑量/g(以公斤體質量原生藥計) 臟器指數(shù)/mg·g-1心肝脾肺腎對照組-4.90±0.6158.85±7.403.94±0.936.38±0.8413.01±1.67知黃潰瘍合劑組120.04.87±0.7361.43±4.664.00±0.696.16±0.8512.64±1.88

注：組間比較P>0.05；-表示未給予知黃潰瘍合劑灌胃。

由表4可知，知黃潰瘍合劑組對小鼠各臟器指數(shù)的影響與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

4 討論

復發(fā)性口腔潰瘍是口腔黏膜疾病中的常見病、多發(fā)病，患病率居口腔黏膜病的首位[4]。西醫(yī)認為該病的發(fā)生與諸多誘因相關[5]，如遺傳[6]、細菌和病毒感染[7]、維生素缺乏[8]、免疫力異常[9-10]和精神壓力[11-12]等，但具體的發(fā)病機制仍不清楚，因而目前西醫(yī)對該病無特效藥[13-14]。現(xiàn)代中醫(yī)在治療口腔潰瘍方面提出了許多見解，如辨證論治[15]、外用藥物治療[16]、針灸治療[17]和中西醫(yī)結合治療[18-19]等。

我院名老中醫(yī)認為口腔潰瘍的發(fā)生責之于素體集熱或陰虛，須通過滋陰清虛熱達到治療目的，擬定知黃潰瘍湯作為協(xié)議處方，臨床應用多年，取得較好的療效?，F(xiàn)將知黃潰瘍湯制成合劑(藥效學實驗結果另文報道)，以期為患者提供便于儲存、攜帶和服用的治療口腔潰瘍藥物。

研究結果顯示，知黃潰瘍合劑毒性較低，按照常規(guī)方法測不出LD50，故以最大給藥量進行急性毒性實驗。給藥后連續(xù)觀察14 d，小鼠生化指標、主要臟器指數(shù)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，主要臟器病理組織學亦未見明顯毒性和不良反應。一般認為，按照體質量計算，小鼠日最大給藥量相當于臨床日用量的100 倍以上則較為安全[20]。本實驗測得小鼠口服知黃潰瘍合劑的最大耐受量為120 g·kg-1原生藥，相當于臨床擬用劑量的109.1倍，提示常規(guī)劑量下服用安全可靠。該制劑臨床用藥周期為3 d，故免做長期毒性實驗。