艽龍膠囊制備中4種主化學(xué)成分的轉(zhuǎn)移率研究

肖會敏，何 悅，雷美娜，常 瑛，劉鐵明，王四旺*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所，西安 710032；2.西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科，西安 710065；3.西安正大制藥有限公司，西安 710043)

艽龍膠囊由秦艽提取物龍膽總苷制成，具有清肝泄熱的功效，用于功能性消化不良，屬肝胃郁熱證者[1]。秦艽是我國重要的傳統(tǒng)中藥材，其主要功效為祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱[1]。陜西和甘肅為秦艽藥材的道地產(chǎn)區(qū)。秦艽主要含有龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、馬錢苷酸和6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷等成分[2-13]。文獻(xiàn)報道，上述4種成分是艽龍膠囊的主要活性成分，其中龍膽苦苷具有保肝利膽、健胃抗炎等作用；獐牙菜苦苷具有鎮(zhèn)痛、退熱和抗驚厥等作用；馬錢苷酸具有抗炎等藥理作用[14-19]。有研究報道，制備過程中的干熱、濕熱和輻照等對秦艽化學(xué)成分有影響[20]，但該膠囊中4種主成分的轉(zhuǎn)移率研究尚未見報道。因此，筆者采用HPLC法，檢測了投料前秦艽藥材和制備成艽龍膠囊的4種成分的含量，探討其主要成分的轉(zhuǎn)移情況，為評價艽龍膠囊制備工藝的科學(xué)性提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010CHT高效液相色譜儀，Labsoluion色譜工作站(日本島津公司)；XP205DR電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ3200E數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 龍膽苦苷(批號110770-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.1%)，馬錢苷酸(批號111865-201403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.7%)，獐芽菜苦苷(批號110785-201404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%)對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院；6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(批號20161102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)對照品，購自上海盛中醫(yī)藥化工有限公司；10批秦艽藥材(批號分別為：20150106，20150208，20150310，20160712，20160914，20160916，20160918，20160920，20160922，20160924，產(chǎn)地均為陜西)；10批艽龍膠囊(批號分別為：20150406，20150503，20150610，20160912，20161013，20161014，20161215，20161216，20170117，20170118)，均由西安正大制藥有限公司提供。HPLC級乙腈、甲醇(美國Fisher公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-1.7 g·L-1磷酸水溶液(B)；梯度洗脫，0～10 min 5%→14%A；10～40 min 14%→18%A，40～60 min 18%→45%A；記錄時間為60 min；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2混合對照品溶液的配制 精密稱取獐芽菜苦苷10.42 mg，置于20 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液A；另稱取馬錢苷酸對照品、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對照品和龍膽苦苷對照品分別為10.56，8.16和19.17 mg，置于同一5 mL量瓶中，加對照品溶液A溶解并定容至刻度，搖勻，得對照品溶液B，即馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷對照品質(zhì)量濃度分別為2 000.06，1 599.36，530.01和3 801.48 μg·mL-1的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3艽龍膠囊供試品溶液的制備 取5粒本品內(nèi)容物，混勻，精密稱取0.17 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量溶解，超聲處理(功率250 kW，頻率40 kHz)30 min，放涼，加甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4秦艽藥材供試品溶液的制備 在投料前將秦艽藥材凈制、干燥，隨機取樣，粉碎，按照文獻(xiàn)[1]中供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系 分別精密量取2.2項下制備的混合對照品溶液0.02，0.10，0.20，0.50和1.00 mL，分別置于5個2 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣。以各對照品溶液的峰面積值為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，計算得線性方程與相關(guān)系數(shù)，見表1和圖1，結(jié)果表明，各對照品在其相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2精密度實驗 精密吸取2.3項下制備的供試品溶液(批號20150406)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的RSD值分別為0.98%，1.06%，0.99%和0.89%，表明該方法精密度良好。

表1對照品的線性方程、質(zhì)量濃度范圍和相關(guān)系數(shù)

Tab.1 Linear equations，concentration ranges and correlation coefficients of the reference substances

對照品線性范圍/μg·mL-1線性方程r馬錢苷酸20.00^2 000.06y1=7 627 902x1-38 3720.999 76′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷15.99^1 599.36y2=15 490 172x2+5 2630.999 4 獐芽菜苦苷 5.30^530.01y3=12 246 403x3+13 8760.999 6龍膽苦苷38.00^3 801.48y4=20 600 531x4+57 4760.999 7

2.5.3穩(wěn)定性實驗 按照2.3項下方法制備艽龍膠囊供試品溶液(批號20150406)，精密吸取上述供試品溶液10 μL，分別在第0，1，2，4，8，16和24 h進(jìn)樣。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷峰面積的RSD值分別為0.91%，0.93%，1.08%和0.97%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4重復(fù)性實驗 取艽龍膠囊樣品(批號20150406)6份，精密稱定，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的平均含量分別為103.63，49.09，8.29和480.80 mg·g-1，RSD值分別為1.19%，1.28%，1.64%和0.72%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5加樣回收率實驗 取艽龍膠囊(批號20150406，其中馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷及龍膽苦苷的含量分別為103.63，49.09，8.29和480.80 mg·g-1)0.17 g，6份，精密稱定，分別按照表2添加各對照品，再按照2.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。

2.5.6藥材與膠囊的含量測定 ①藥材：分別按照2.4項下方法制備秦艽藥材供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。見圖1。10批藥材樣品中馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的含量及RSD值見表3。②膠囊：取10批膠囊樣品，分別按照2.3項下方法制備艽龍膠囊供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。見圖1。10批膠囊樣品中馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的含量、RSD值及4種成分的轉(zhuǎn)移率見表3。

圖1HPLC圖

A.混合對照品；B.秦艽藥材供試品溶液；C.艽龍膠囊供試品溶液；1.馬錢苷酸；2.6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；3.獐芽菜苦苷；4.龍膽苦苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixture reference substances；B.GentianamacrophyllaRadix sample;C.Jiaolong Capsules sample;1.loganic acid；2.6′-O-β-D-glucosylgentiopicroside；3.swertiamarin;4.gentiopicroside.

表2加樣回收率測定結(jié)果

Tab.2 Results of sample recovery test

成分樣品量/g原有量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%馬錢苷酸0.173 617.990 214.4032.122 498.140 398.671.0290.172 617.886 514.4032.245 699.716 00.174 318.062 718.0036.027 199.802 20.172 717.896 918.0035.384 297.151 70.171 817.803 621.6039.165 198.895 80.172 717.896 921.6039.129 198.297 26′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷0.173 68.522 06.8015.149 197.457 497.111.8520.172 68.472 96.8015.130 997.911 80.174 38.556 48.5016.946 498.705 90.172 78.477 88.5016.511 794.516 50.171 88.433 710.2018.510 198.788 20.172 78.477 810.2018.197 495.290 2獐芽菜苦苷0.173 61.439 11.122.539 298.223 298.351.4260.172 61.430 91.122.548 699.794 60.174 31.444 91.402.795 996.500 00.172 71.431 71.402.823 899.435 70.171 81.424 21.683.051 296.845 20.172 71.431 71.683.099 699.279 8龍膽苦苷0.173 683.466 966.40148.091 197.325 697.891.1500.172 682.986 166.40148.610 798.832 20.174 383.803 483.00165.495 998.424 70.172 783.034 283.00163.030 996.381 60.171 882.601 499.60181.495 999.291 70.172 783.034 299.60179.754 697.108 8

表3秦艽藥材與艽龍膠囊中4種成分含量及轉(zhuǎn)移率的測定結(jié)果

Tab.3 Results of the 4 components contents and their transfer rates inGentianamacrophyllaRadix and Jiaolong Capsules (n=3)

類別批號馬錢苷酸6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷獐芽菜苦苷龍膽苦苷藥材中含量201501061.680.530.225.49/g·g-1201502082.200.430.346.12201503101.790.560.256.07201607121.240.490.206.08201609141.710.530.406.28201609161.390.490.196.07201609181.550.530.205.81201609201.590.470.375.61201609221.350.520.255.99201609241.430.520.226.15膠囊中含量20150406103.6349.098.29480.80/mg·g-120150503103.2839.698.16472.6120150610104.0948.828.34480.4520160912102.6241.028.23480.9120161013104.5949.138.26474.1520161014101.7042.368.21479.0220161215103.4749.128.32488.8320161216104.4544.158.07472.9120170117104.9248.338.35498.1320170118104.1445.148.27483.78轉(zhuǎn)移率/%20150106-2015040664.4196.5138.7491.2620150208-2015050348.9096.1824.7589.5220150310-2015061060.5790.8435.1092.7920160712-2016091286.4787.2343.1296.1520160914-2016101363.7696.5921.3487.7520160916-2016101476.4790.0844.6781.4720160918-2016121569.4596.5743.8585.9320160920-2016121668.4997.8822.9991.7820160922-2017011781.0196.8534.1684.4320160924-2017011875.7790.4538.9094.99平均值/%69.5393.9234.7689.61RSD/%15.704.0725.435.25

3 討論

3.1色譜條件的確定 由于原料藥材與膠囊成分均較復(fù)雜，等度洗脫難以達(dá)到分離檢測目的，因此采用梯度洗脫的方法。對流動相系統(tǒng)乙腈-磷酸水溶液(0.85，1.7和3.4 g·L-1)、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液(1.0,2.0和3.0 mL·L-1)和乙腈-水進(jìn)行比較，結(jié)果表明，乙腈-1.7 g·L-1磷酸水溶液流動相較理想。測定4種化合物含量檢測波長的選擇，根據(jù)二極管陣列檢測器對馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷進(jìn)行掃描，結(jié)果馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷吸收值在254 nm處時，適用性實驗各指標(biāo)均符合分析檢測要求，故選擇其作為檢測波長。本膠囊主要為體積分?jǐn)?shù)80%乙醇提取物，因此使用甲醇作為溶劑，采用不同時間(10，15，20，30，40，50和60 min)浸泡或超聲處理方法或加熱回流，結(jié)果表明，制樣方法為用甲醇作溶劑超聲30 min。同時選擇易于控制的柱溫30 ℃與流速1.0 mL·min-1，此時目標(biāo)物色譜峰分離度良好；色譜記錄時間在60 min后，無確認(rèn)譜峰出現(xiàn)。

3.2各溶液制備方法的選擇 各對照品溶液與供試品溶液參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行制備[7]；藥材依據(jù)文獻(xiàn)方法[1]對應(yīng)項下要求制備。

3.34種成分的含量分析 分別對10批秦艽藥材和10批艽龍膠囊的含量進(jìn)行測定，表明4種成分分別在不同批次間含量不均一，說明不同產(chǎn)地藥材中成分的含量存在一定差異，但在生產(chǎn)過程中的影響較小。

3.4轉(zhuǎn)移率分析 對10批藥材對應(yīng)10批艽龍膠囊中的4種成分含量進(jìn)行分析，馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷和龍膽苦苷的轉(zhuǎn)移率分別為48.90%～86.47%，21.34%～44.67%,87.23%～97.88%和81.47%～96.15%。但本膠囊的主要活性成分為龍膽苦苷。因此，主要活性成分大部分轉(zhuǎn)移至膠囊中，說明膠囊制備工藝良好。

結(jié)果表明，該含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于秦艽藥材與艽龍膠囊中馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的含量分析；龍膽苦苷為該膠囊主要成分且轉(zhuǎn)移率高，表明該膠囊制備工藝良好，為膠囊的質(zhì)量提供了保障。