馬鈴薯不同起始外植體不定根快速誘導(dǎo)體系的建立

張紫娟 ，侯雷平 ，薛紅衛(wèi) ，許智宏 ，4，朱木蘭 2，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；2.中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心，上海辰山植物園，上海201602；3.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所，上海200032；4.北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，北京100080）

油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BL）又名蕓苔素內(nèi)酯，是一種新型植物內(nèi)源激素，在國際上已被列為第六大類植物激素[1]。20世紀70年代初，美國科學(xué)家MITCHELL等[2]首次從油菜花粉中分離出了對植物生長具有調(diào)節(jié)功能的生理活性物質(zhì)，將其命名為油菜素（Brassins）。1979年，GROVE 等[3]分離出油菜素，并鑒定了其分子立體結(jié)構(gòu)，確認該物質(zhì)為一種甾醇類化合物，并正式將其命名為油菜素內(nèi)酯。目前，在植物界已發(fā)現(xiàn)了60多種油菜素內(nèi)酯類化合物，統(tǒng)稱為油菜素內(nèi)酯化合物（Brassinosteroids，BRs）[4]。

作為一種類固醇類激素，油菜素內(nèi)酯在植物生長發(fā)育過程中起著不可忽視的作用，它能促進細胞伸長，影響細胞的分裂分化，促進植物進入生殖生長，影響花誘導(dǎo)及分化，同時還能提高植物對逆境條件的抵御能力[5]。而2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide,EBR）是其中用途較廣泛、使用較多的一種[6]，且近年來對它的研究越來越多，如在種子萌發(fā)、幼苗生長等方面，而在農(nóng)作物離體再生方面的應(yīng)用效果鮮見報道。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）屬雙子葉植物綱茄科茄屬，1年生草本植物，是一種糧菜兼用作物，具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、分布范圍廣等特點；又是很多加工產(chǎn)品的原材料，用途廣泛，產(chǎn)業(yè)鏈長，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及人民生活中具有不可替代的作用[7]。自2016年馬鈴薯被作為主糧產(chǎn)品進行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)后，其栽培面積更加廣泛，產(chǎn)業(yè)規(guī)模大幅提高，馬鈴薯種苗市場的需求量顯著增加[8]。因此，急需馬鈴薯高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的種苗生產(chǎn)方法。

離體再生技術(shù)為馬鈴薯的種質(zhì)資源創(chuàng)新、種苗脫毒快速繁殖、工廠化育苗提供了有效途徑。因此，在馬鈴薯物種上應(yīng)用離體再生技術(shù)時，縮短馬鈴薯離體再生過程中的滯瓶期，加快工廠化出苗進程尤為重要。

本研究以馬鈴薯品種大西洋無菌試管苗為試材，以2，4-表油菜素內(nèi)酯為主導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)劑，對馬鈴薯不同起始外植體不定根快速誘導(dǎo)的最佳體系進行了篩選，以期為日后馬鈴薯離體再生的相關(guān)研究以及工廠化育苗提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為上海辰山植物科學(xué)研究中心遺傳轉(zhuǎn)化平臺儲備提供的馬鈴薯品種大西洋的無菌苗。

1.2 基本培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂粉，pH值調(diào)至5.80；所有培養(yǎng)基均經(jīng)121℃滅菌17 min，植物激素經(jīng)過濾滅菌后添加到受試培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為光照強度1 500～2 500 lx，光照時長 16 h/d，溫度（23±1）℃。

1.3 試驗方法

選取長勢良好的幼苗（2.0～3.0 cm）、莖段（1.0～1.5 cm，帶腋芽芽點）、葉片（帶葉柄）接種至含有不同質(zhì)量濃度 EBR（0，0.01，0.05，0.1，0.5，1.0 mg/L)和NAA（0，0.1 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，并進行多次重復(fù)試驗。

1.3.1 幼苗 每瓶接種3～5個，記錄生根啟動天數(shù)、平均生根天數(shù)（即當(dāng)根滿足根條數(shù)＞5條、根長度＞4 cm時的天數(shù)），10 d后統(tǒng)計生根頻率以及幼苗的平均不定根數(shù)。

1.3.2 莖段 每培養(yǎng)皿接種10個，記錄生根啟動天數(shù)，10 d后統(tǒng)計生根頻率以及不定芽誘導(dǎo)率。

1.3.3 葉片 每培養(yǎng)皿接種10個，記錄生根啟動天數(shù)，15 d后統(tǒng)計生根頻率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2013和IBM SPSSStatistics Version 20軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 大西洋馬鈴薯幼苗的不定根離體發(fā)生情況

將長勢良好的幼苗轉(zhuǎn)接至不定根離體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中3～7 d后，幼苗陸續(xù)出現(xiàn)不定根。從表1可以看出，與不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的處理，啟動時間和平均生根天數(shù)均較短，生根頻率和平均不定根數(shù)均有所增加，且只添加0.1 mg/L NAA的處理效果更明顯（圖1-A，B，C）。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，隨著EBR質(zhì)量濃度的升高，不定根發(fā)生的啟動天數(shù)逐漸減少，平均生根天數(shù)先減少后增加、生根頻率以及平均不定根數(shù)先升高后下降。當(dāng)EBR質(zhì)量濃度為0.01 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，幼苗不定根誘導(dǎo)效果最佳，啟動時間約為4 d左右，平均生根天數(shù)約10 d，生根頻率可達99.39%，幼苗平均不定根數(shù)為11.93條，根較健壯，根系較發(fā)達，有利于提高后續(xù)的移栽存活率（圖1-D）。EBR質(zhì)量濃度為0.05 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1mg/L的處理，與EBR質(zhì)量濃度為0.01mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的處理相比，啟動時間和平均生根天數(shù)相近，差別不大，生根頻率和幼苗平均不定根數(shù)略低，但其根系有大量側(cè)根發(fā)生，可增加移栽后與土壤的接觸面積，提高移栽成活率（圖1-E）。而當(dāng)EBR質(zhì)量濃度為0.1 mg/L或大于0.1 mg/L時，生根效果不理想，甚至出現(xiàn)抑制生根現(xiàn)象（圖 1-F，G，H）。

因此，誘導(dǎo)大西洋馬鈴薯幼苗不定根離體發(fā)生的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.01 mg/LEBR＋0.1 mg/L NAA。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對大西洋馬鈴薯幼苗不定根離體發(fā)生的影響

2.2 大西洋馬鈴薯莖段的不定根離體發(fā)生情況

將長勢良好的莖段轉(zhuǎn)接至不定根離體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中3～7 d后，莖段陸續(xù)出現(xiàn)不定根。

由表2可知，與不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的處理，啟動時間均有所減少，生根頻率和平均不定根數(shù)均有所增加，其中，以只添加0.1 mg/L NAA的處理生根頻率較高，為68.33%；以只添加0.01mg/LEBR的處理不定芽誘導(dǎo)率較高，為45.16%（圖 2-A，B，C）。

當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，隨著EBR質(zhì)量濃度的升高，莖段不定根發(fā)生的啟動天數(shù)逐漸減少，生根頻率和不定芽誘導(dǎo)率先升高后下降。EBR質(zhì)量濃度為0.01 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的處理和EBR質(zhì)量濃度為0.05 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的處理生根頻率均較高，分別為99.49%和99.10%，但后者的不定芽誘導(dǎo)率最高，為81.07%，且芽較健壯（圖2-D，E）。而當(dāng)EBR質(zhì)量濃度較高時，生根頻率明顯降低，不定芽誘導(dǎo)效果也減弱（圖2-F，G，H）。

可見，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，低質(zhì)量濃度的EBR對莖段的不定根發(fā)生有促進作用；但當(dāng)質(zhì)量濃度較高時，出現(xiàn)抑制生根現(xiàn)象；此外，EBR在誘導(dǎo)不定芽方面有促進作用。

因此，誘導(dǎo)大西洋馬鈴薯莖段的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.05 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對大西洋馬鈴薯莖段不定根離體發(fā)生的影響

2.3 大西洋馬鈴薯葉片的不定根離體發(fā)生情況

將長勢良好的葉片轉(zhuǎn)接至不定根離體誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中5～10 d后，葉片陸續(xù)出現(xiàn)不定根。從表3可以看出，與不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理相比，只添加0.1 mg/L NAA和只添加0.01 mg/L EBR的處理，啟動時間有所減少，生根頻率有所增加，且只添加0.1 mg/L NAA的處理效果更明顯（圖3-A，B，C）。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，隨著EBR質(zhì)量濃度的增加，葉片的生根頻率先升高后降低；當(dāng)EBR質(zhì)量濃度為0.05 mg/L時，葉片生根頻率最高，為82.06%，且根較粗壯，長勢良好（圖3-E）；但當(dāng)EBR質(zhì)量濃度高于0.05 mg/L時，葉片生根頻率均較低，且根較細短，且隨著EBR質(zhì)量濃度的增加，葉片明顯變黃，但仍比不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的處理生根效果好（圖3-F，G，H）?？梢姡珽BR對馬鈴薯葉片的生根有一定的促進作用，低濃度的EBR能有效加強促進生根的效果。因此，誘導(dǎo)大西洋馬鈴薯葉片不定根離體發(fā)生的最佳培養(yǎng)基配方為MS＋0.05 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對大西洋馬鈴薯葉片不定根離體發(fā)生的影響

3 結(jié)論與討論

將2，4-表油菜素內(nèi)酯與馬鈴薯的離體再生相結(jié)合，為馬鈴薯不定根快速誘導(dǎo)提供了新的途徑。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的2，4-表油菜素內(nèi)酯對馬鈴薯不定根的發(fā)生有促進作用，幼苗在MS＋0.01 mg/LEBR＋0.1 mg/LNAA培養(yǎng)基中，生根頻率可達到99.39%，每個無菌苗的平均不定根數(shù)為11.93條，且在2，4-表油菜素內(nèi)酯作用下，幼苗的不定根發(fā)生的啟動時間均較短，為3～5 d，最佳平均生根天數(shù)約為10 d。鮑紅春等[9]以馬鈴薯品種隴薯5號的莖段為起始外植體，將其分化出來的健壯小苗在誘導(dǎo)生根時，15 d左右可觀察到根的發(fā)生。白穎等[10]以馬鈴薯加工品種Shepody葉片、莖段為外植體，其不定芽長到2～3 cm時，將其剪下，置于MS基本培養(yǎng)基中，約10 d時可產(chǎn)生不定根，20 d時可進行離體擴繁。崔海辰等[11]研究表明，在外植體不定芽長到2～3 cm時，將其剪下，置于生根培養(yǎng)基中大概10 d時可看到不定根產(chǎn)生，到20 d時根的生長量大大增加?？梢?，在本研究中，2，4-表油菜素內(nèi)酯的應(yīng)用可顯著減少馬鈴薯再生苗的生根時間，縮短組培苗滯瓶期，加快煉苗移栽進程，并且適當(dāng)濃度的2，4-表油菜素內(nèi)酯可使莖段、葉片直接誘導(dǎo)不定根。這與閆慧芳等[12]對有關(guān)油菜素內(nèi)酯對巨桉組培中不定根誘導(dǎo)的研究結(jié)果一致?？蓢L試將2，4-表油菜素內(nèi)酯應(yīng)用于其他作物的快速發(fā)根上，以縮短生根時間。

李程等[13]研究表明，油菜素內(nèi)酯化合物是國際上公認的一類高效、無毒的新型植物甾醇類生長激素。其能有效改善高溫、低溫、重金屬、干旱、病菌侵染等多種生物與非生物逆境脅迫對植物體造成的傷害，增強植株對逆境脅迫的耐受力[14-17]。而馬鈴薯雖營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高、生育期短，但其易出現(xiàn)主要由病毒病引起的品種退化問題[18]。據(jù)統(tǒng)計，世界每年因病毒病造成的馬鈴薯減產(chǎn)至少在20%以上，嚴重時減產(chǎn)達到80%[19]。將2，4-表油菜素內(nèi)酯應(yīng)用于馬鈴薯的離體再生，不僅能縮短組培苗滯瓶期、加快種苗工廠化以及產(chǎn)業(yè)化進程，更有望提高馬鈴薯種苗的抗逆性，增強其對環(huán)境脅迫的抵抗能力，以實現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目標。