納米磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)在甲狀腺微小乳頭狀癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值

詹宇紅 馬麗珍 張險(xiǎn)峰 黃佼 韓輝 徐哲奕

近年來(lái)，甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）的發(fā)病率越來(lái)越高。PTMC由于瘤體小，易導(dǎo)致誤診、漏診。納米磁珠聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（magnetic bead combined with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)是一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段，在臨床上主要應(yīng)用于相關(guān)疾病尤其是惡性腫瘤的診斷和鑒別，具有較高的靈敏度和特異度。本研究擬應(yīng)用納米磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，檢測(cè)PTMC患者的血清蛋白標(biāo)志物，篩選PTMC患者血清中的特異性表達(dá)差異蛋白，并結(jié)合生物信息學(xué)方法建立診斷模型。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 抽取2014年1月至2016年1月我院65例PTMC患者血清和45例健康體檢者血清。所有PTMC經(jīng)2位病理學(xué)專家證實(shí)。血清標(biāo)本按隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組60例（包括PTMC 35例，健康體檢者血清25例）和驗(yàn)證組50例（包括PTMC 30例和健康體檢者血清20例）。

1.2 主要材料和儀器 三氟乙酸、芥子酸飽和溶液、去離子水購(gòu)自日本Sigma公司。處理液、緩沖液、弱陽(yáng)離子交換型納米磁珠試劑盒來(lái)自浙江愛(ài)睦世醫(yī)學(xué)科技有限公司。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀來(lái)自美國(guó)Ciphergen Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有受試者空腹經(jīng)肘靜脈采血2ml，采集后立即于 4℃冰箱靜置 2h，4℃、4000r/min離心10min分離血清，將血清于 4℃、12000r/min離心10min，去除所有殘留細(xì)胞碎片和不溶物，在冰上將血清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，保存于-80℃冰箱。避免反復(fù)凍融。

1.3.2 血清樣品處理 從-80℃冰箱中取出血清，于4℃、10000r/min離心 5min。取 10μl血清樣品，加20μl U9處理液。充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入370μl結(jié)合緩沖液立即混勻。

1.3.3 芯片及磁珠清洗 將蛋白芯片裝入bio-緩沖液，室溫振蕩洗滌2次，5min/次，甩干。每離心管分別加入100μl磁珠溶液，置磁性處理器上，吸去上清液，加入200μl緩沖液，室溫下磁性處理器洗滌2次，5min/次，吸干液體，再用去離子水洗滌1次，吸干液體。

1.3.4 樣品的磁珠處理及上樣 采用弱陽(yáng)離子交換型納米磁珠試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行處理，具體如下：加至已處理好的弱陽(yáng)離子交換型納米磁珠的離心管中，置磁性處理器上孵育，除去液體，加弱陽(yáng)離子交換型納米磁珠結(jié)合緩沖液至已裝好磁珠的離心管，置磁性處理器上孵育，除去液體，重復(fù)上述操作2次，加5%三氟乙酸洗脫液20μl，反應(yīng)8min，置磁性處理器至液體上清。取5μl上清液移植至另一個(gè)離心管中，加入5μl芥子酸飽和溶液充分混勻，取1μl混合溶液加樣到Au芯片上，晾干后上MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀讀取信息，收集數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Biomarker Wizard軟件，對(duì)所有蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（Mann-Whitney U檢驗(yàn)），計(jì)算P值，找出試驗(yàn)組間血清蛋白質(zhì)峰的差異。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用Biomarker Patterns5.0軟件識(shí)別診斷PTMC最佳標(biāo)志物，建立決策樹(shù)診斷模型。驗(yàn)證組中驗(yàn)證模型。對(duì)診斷和驗(yàn)證結(jié)果均采用ROC曲線，AUC作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型構(gòu)建 收集并分析試驗(yàn)組中35例PTMC患者和25例健康體檢者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)，在質(zhì)荷比m/z為2000~50000范圍內(nèi)檢測(cè)共得到兩者間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰19個(gè)，其中單獨(dú)區(qū)分PTMC和健康體檢者能力最強(qiáng)的2個(gè)差異蛋白質(zhì)峰 m/z為 7979.56、3320.19（表 1），建立決策樹(shù)模型（圖1），所構(gòu)建組合可達(dá)到最佳診斷效果。用此模型分析35例PTMC樣本，其中35例區(qū)分正確，靈敏度為1；分析25份正常健康體檢者樣本，24份區(qū)分正確，1份區(qū)分錯(cuò)誤，特異度為0.96。AUC為0.981（圖2）。

表1 試驗(yàn)組PTMC患者和健康體檢者差異蛋白質(zhì)峰的表達(dá)

圖1 試驗(yàn)組PTMC患者與健康體檢者血清決策樹(shù)

圖2 試驗(yàn)組診斷模型ROC曲線

2.2 驗(yàn)證模型 用m/z為7979.56、3320.19差異蛋白質(zhì)峰組成的診斷模型盲法分析驗(yàn)證組50例血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。30例PTMC患者血清樣本中26例區(qū)分正確，4份區(qū)分錯(cuò)誤，靈敏度為0.87；20份正常健康體檢者血清樣本中18份區(qū)分正確，2例區(qū)分錯(cuò)誤，特異度為0.90。盲法驗(yàn)證的AUC為0.910（圖3），進(jìn)一步驗(yàn)證了所建立模型的準(zhǔn)確性。

圖3 驗(yàn)證組診斷模型的ROC曲線

3 討論

201 4年WHO公布的全球癌癥報(bào)告中指出，甲狀腺癌新發(fā)病例中超過(guò)50%為PTMC，占甲狀腺癌診療的重要比例。超聲影像檢查及超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺是首選的診斷手段，但也存在一定的漏診。PTMC臨床漏診的原因主要包括：（1）病灶小而隱蔽，觸診很難發(fā)現(xiàn)；（2）超聲影像學(xué)人員技術(shù)局限；（3）細(xì)針穿刺結(jié)果不能診斷或意義未明。2016年我國(guó)發(fā)布了針對(duì)PTMC的診治指南，認(rèn)為PTMC有較好的生物學(xué)行為，總體治療效果好，多數(shù)經(jīng)外科手術(shù)可根治，5年生存率可達(dá)98.5%[1]，但也有部分患者可出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)[2]，故也需要提高診斷率，確定合適的治療時(shí)機(jī)和方式。有研究發(fā)現(xiàn)超聲彈性成像對(duì)于甲狀腺微小癌的診斷具有較高的診斷價(jià)值，靈敏度0.881、特異度0.894[3]，也有探討其它放射學(xué)手段如核磁共振質(zhì)子波譜分析[4]，單源雙能譜CT成像[5]診斷PTMC，但指南并不推薦。輔助分子標(biāo)志物的檢測(cè)可使PTMC的術(shù)前診斷率進(jìn)一步提升，對(duì)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)不確定的，可聯(lián)合如BRAF分子標(biāo)志物的檢測(cè)，基因突變檢測(cè)在判斷疾病侵襲性、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后上可能具有更大的臨床價(jià)值[6]。

MALDI-TOF-MS技術(shù)由質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展而來(lái)，是一種包含層析與質(zhì)譜的特殊蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，綜合了芯片微陣列與質(zhì)譜技術(shù)兩者的優(yōu)點(diǎn)，能很好地捕獲人血清中的小分子多肽和蛋白質(zhì)，在臨床上主要應(yīng)用于胃癌、卵巢癌、肺癌[7-9]等惡性腫瘤的診斷和鑒別，尋找新的腫瘤標(biāo)志物。在甲狀腺領(lǐng)域，也有利用該技術(shù)檢測(cè)血清標(biāo)本，建立過(guò)甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型，特異度為0.83，靈敏度為0.88[10]。本研究采用納米磁珠聯(lián)合MALDI-TOF-MS技術(shù)，對(duì)血清高通量篩選PTMC表達(dá)的各種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)分子，確定和篩選特異的腫瘤標(biāo)志物，建立了PTMC血清蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型，診斷靈敏度0.87，特異度0.90，可能成為一種有效的輔助診斷手段，但是需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，以期為PTMC的合理診斷及治療提供有價(jià)值的信息。