未折疊蛋白反應(yīng)與神經(jīng)管缺陷關(guān)系的研究進(jìn)展

劉菊芬

神經(jīng)管缺陷(neural tube defects，NTDs)是常見的先天性中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，病因復(fù)雜，致病機(jī)制不清楚。重金屬暴露、高熱、高糖、必需營養(yǎng)素的缺乏等顯著增加NTDs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、caspase 8依賴性細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬等與NTDs發(fā)生有關(guān)。未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)是一種早期的針對外界環(huán)境因素的應(yīng)激反應(yīng)，外界環(huán)境刺激加劇以及時(shí)間延長，UPR會失去作用并啟動細(xì)胞自噬、凋亡導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)異常。本綜述試圖從UPR信號通路的角度來探討外環(huán)境暴露導(dǎo)致NTDs發(fā)生的作用機(jī)制。

一、神經(jīng)管缺陷概述

NTDs是胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合不全引起的一組嚴(yán)重先天缺陷，包括無腦、脊柱裂和腦膨出等常見亞型。全球NTDs平均患病率為1‰，高發(fā)地區(qū)為4‰～10‰[1-2]，是繼先天性心臟病之后最主要的先天缺陷類型。NTDs病因復(fù)雜，是基因、環(huán)境以及基因和環(huán)境交互作用共同作用的結(jié)果，致病機(jī)制仍然不清楚。我國是神經(jīng)管缺陷高發(fā)國家之一。20世紀(jì)90年代的研究表明圍孕期增補(bǔ)葉酸可顯著降低NTDs發(fā)生[3]，2009年免費(fèi)葉酸增補(bǔ)計(jì)劃在全國農(nóng)村開展[4]，在北方出生缺陷高發(fā)的部分縣以人群為基礎(chǔ)的出生缺陷監(jiān)測結(jié)果顯示全面增補(bǔ)葉酸后NTDs患病率顯著下降，2004—2014年間從12‰下降到3.2‰，但是仍舊遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于美國等發(fā)達(dá)國家[2]。NTDs是導(dǎo)致早期流產(chǎn)、死胎死產(chǎn)的重要原因，存活者往往伴有先天殘疾，給家庭和社會造成嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為影響我國出生人口素質(zhì)的主要原因之一。加強(qiáng)NTDs病因和致病機(jī)制研究將為預(yù)防和減少出生缺陷、提高出生人口質(zhì)量提供重要線索。

二、未折疊蛋白反應(yīng)

蛋白質(zhì)的功能主要取決于其空間結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是多肽鏈折疊的結(jié)果，折疊過程發(fā)生錯誤將會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。UPR是細(xì)胞應(yīng)對蛋白折疊錯誤的一系列信號傳遞過程，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)生成減慢、非折疊蛋白被降解、蛋白質(zhì)折疊功能加強(qiáng)等。細(xì)胞應(yīng)激涉及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核的應(yīng)激。UPR的生理后果由基因表達(dá)改變所介導(dǎo)[5]。UPR作為一條綜合的細(xì)胞內(nèi)信號通路，已有研究報(bào)道較多的有線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(mitochondrial unfolded protein response，UPRmt)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)(endoplasmic reticulum unfolded protein response，UPRer)。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，參與細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，如細(xì)胞凋亡、干擾素信號通路等[6]。UPRmt是指在各種應(yīng)激條件下，線粒體基質(zhì)積累大量未折疊、錯誤折疊以及無效蛋白質(zhì)，導(dǎo)致核編碼靶向線粒體分子伴侶蛋白以及蛋白水解酶表達(dá)上調(diào)，如熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp:Hsp70、Hsp60、Hsp10)、YME1樣ATP酶和線粒體Lon蛋白酶樣蛋白等；其中伴侶蛋白幫助發(fā)生錯誤折疊蛋白恢復(fù)正常構(gòu)象以及新合成蛋白正確折疊，蛋白酶降解無用蛋白；這種由線粒體至核的逆行信號傳導(dǎo)過程即為UPRmt[7-8]。研究者最早通過超表達(dá)線粒體基質(zhì)定位的末端錯誤折疊的鳥苷酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶證明UPRmt的存在[9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)功能受損的線粒體主要通過線粒體自噬途徑降解，以此來維持細(xì)胞內(nèi)線粒體網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)。值得注意的是，能夠誘導(dǎo)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)的刺激也最終能夠誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，如線粒體DNA缺失、線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈復(fù)合物突變、線粒體內(nèi)積累大量錯誤折疊的蛋白質(zhì)等應(yīng)激信號首先激活UPRmt，若UPRmt不足以改善線粒體應(yīng)激，則這種功能受損的線粒體經(jīng)過線粒體自噬的途徑降解，由此引起進(jìn)一步的線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulurn，ER)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)生成和鈣離子貯存的細(xì)胞器，分泌蛋白和膜蛋白需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊、組裝、加工、包裝及向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞受到內(nèi)外因素的刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、功能的平衡狀態(tài)受到破壞后發(fā)生分子生化的改變，蛋白質(zhì)加工運(yùn)輸受阻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，細(xì)胞會采取相應(yīng)的應(yīng)答措施，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核傳輸一系列錯綜復(fù)雜的信號，通過減少蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，增加幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶等方式緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力、彌補(bǔ)外源性損傷和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的恢復(fù)，這種現(xiàn)象被稱為UPRer [10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等共同作用導(dǎo)致疾病。引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的因素很多，缺血低氧、葡萄糖或營養(yǎng)物匱乏、鈣離子紊亂等可造成急性應(yīng)激損傷；而病毒感染、分子伴侶或其底物的基因突變等能引發(fā)慢性應(yīng)激損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅能激活死亡受體，當(dāng)激活效應(yīng)超過降解效應(yīng)時(shí)，細(xì)胞會啟動死亡程序，也與炎癥反應(yīng)、胰島素合成分泌有密切聯(lián)系[10]。UPRer主要包括蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase receptor-like ER kinase，PERK)、肌醇需求酶-1α(inositol requiring enzyme 1α，IRE 1α)和活性轉(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor 6，ATF6)三類重要分子[11]。

三、未折疊蛋白反應(yīng)與神經(jīng)管缺陷的關(guān)系

重金屬暴露、高熱、高糖、必需營養(yǎng)素的缺乏、高同型半胱氨酸血癥、PI3K/Akt/GSK-3β通路基因突變等顯著增加NTDs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；NTDs發(fā)生與氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、caspase 8依賴性細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬等通路有關(guān)，UPRmt和UPRer可能在NTDs發(fā)生中有重要作用，機(jī)制有待繼續(xù)研究。

1.重金屬

近年來研究發(fā)現(xiàn)UPRmt在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[12]。作為細(xì)胞對外界刺激早期產(chǎn)生的一種應(yīng)答反應(yīng)，環(huán)境污染物暴露可誘發(fā)UPRmt激活。重金屬錳通過血腦屏障或嗅神經(jīng)后直接作用于神經(jīng)元，使得神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生蛋白折疊錯誤以及新合成蛋白不能折疊等情況，UPRmt信號通路被激活，熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP；包括Hsp10/Hsp27/Hsp60/Hsp70等)表達(dá)增加，促進(jìn)錯誤折疊蛋白和損傷蛋白的清除；錳過量或長時(shí)間暴露后，UPRmt信號通路被抑制，線粒體功能障礙，發(fā)生線粒體自噬甚至細(xì)胞凋亡和壞死，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)。污染物通過誘導(dǎo)線粒體錳超氧化物歧化酶(manganese-dependent superoxide dismutase，MnSOD) 基因表達(dá)，使線粒體基質(zhì)內(nèi)的活性氧堆積，損傷線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)，誘發(fā)UPRmt。藥物三氧化二砷特異性干擾線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶23(TIM23) 及YME1 L1 介導(dǎo)的內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶(TIM17a)降解，誘發(fā)UPRmt[13]。

錳染毒SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞活力下降，凋亡率上升，不同染毒組凋亡率呈明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，Hsp10表達(dá)(mRNA和蛋白)下降[14]，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和Beclin1表達(dá)水平明顯增加，PI3K/AKT/GSK3β被抑制，細(xì)胞凋亡增加[15]。UPRmt分子伴侶Hsp60通過PINK1 / Parkin 途徑發(fā)揮作用。在PINK1損失的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)，線粒體Hsp60表達(dá)下調(diào)40%。這可能是Parkin 和PINK1與Hsp60互動關(guān)閉UPRmt，此時(shí)線粒體被認(rèn)為因過度受損不能恢復(fù)；如果UPRmt持續(xù)發(fā)生，Hsp60可能引起線粒體自噬[16]。錳可以通過FOXO3細(xì)胞核滯留促進(jìn)了線粒體自噬[17]。

環(huán)境錳暴露對妊娠結(jié)局及后代發(fā)育有不良影響[18]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管缺陷組胎盤錳元素顯著高于健康對照組，含量分別為131.60 ng/g(interquartile range,IQR:99.25-166.76)和101.54 ng/g(IQR：80.14-119.79)[19]。胎盤錳含量與NTDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，胎盤錳含量在中位數(shù)以上水平組發(fā)生NTDs的風(fēng)險(xiǎn)為胎盤錳含量中位數(shù)以下組的4倍(OR=4.25，95% CI，1.23-14.79)，胎盤高濃度錳與NTDs發(fā)生有關(guān)，是否通過UPR及其通路，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

2.高熱

Hsp作為UPRmt的分子伴侶，在高溫導(dǎo)致的胚胎發(fā)育缺陷過程中發(fā)揮重要作用[20-21]。孕期高熱與中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形(包括神經(jīng)管缺陷和小頭畸形)有關(guān)[22]，Hsp主要影響小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的增殖和分化[20]。研究者通過觀察熱休克對小鼠胚胎干細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，HSP編碼基因上調(diào)、誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞增殖的時(shí)間抑制和分化遲緩，以至于嚴(yán)重的熱休克作用導(dǎo)致幾乎所有的細(xì)胞消失，其余的細(xì)胞失去增殖和分化的能力；為NSCs溫度依賴性效應(yīng)在闡明妊娠期高溫引起各種生殖問題的機(jī)制方面提供了線索。雞胚中研究發(fā)現(xiàn)汞、鎘、砷等暴露加速Hsp 24,70，90的合成，放線菌素D實(shí)驗(yàn)表明，亞砷酸鹽誘導(dǎo)的這些蛋白質(zhì)的表達(dá)是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的[23]；抑制Hsp70-1和Hsp70-3的表達(dá)導(dǎo)致亞砷酸鹽誘導(dǎo)的神經(jīng)管缺陷的發(fā)生率增加6倍。通過顯微注射具有Hsp70-1編碼區(qū)組成啟動子驅(qū)動表達(dá)的轉(zhuǎn)基因來實(shí)現(xiàn)HSP功能的增加，并導(dǎo)致亞砷酸鹽誘導(dǎo)的神經(jīng)管缺陷的發(fā)生率降低[24]。

3.妊娠期糖尿病

高糖在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)神經(jīng)管缺陷。動物研究表明，高血糖條件下由于活性氧的產(chǎn)生增強(qiáng)和抗氧化能力受損導(dǎo)致胚胎表現(xiàn)出高水平的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激激活一系列促凋亡激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中間體，導(dǎo)致胚胎神經(jīng)管細(xì)胞異常死亡，導(dǎo)致NTDs形成。在嚙齒動物模型中，母體糖尿病激活了凋亡前UPR[25]。凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1 (apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)——叉頭轉(zhuǎn)錄因子3a(forkhead transcription factor 3a，F(xiàn)oxO3a)——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase 8)通路的激活引起發(fā)育中的神經(jīng)管細(xì)胞的凋亡，該通路抑制后可以預(yù)防糖尿病引起的出生缺陷[26]。ASK1通過激活c-Jun-N-末端激酶1/2(c-Jun-N-Terminal kinase 1/2，JNK1/2)激活UPR和ER應(yīng)激。分子研究進(jìn)一步表明，PRKC、ASK1、JNK1或JNK2基因的缺失消除了母親糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)祖細(xì)胞凋亡，減少NTDs。此外，具有ED富尾的CBP/P300相互作用反式激活子(CBP/p300-interacting transactivator with ED-rich tail 2，CITED2)是胚胎發(fā)生所必需的轉(zhuǎn)錄輔助因子，其缺失通過增加神經(jīng)干細(xì)胞凋亡引起NTDs。高糖水平時(shí)miR-200b升高、CITED2表達(dá)下調(diào)，miR-200b和CITED2在胚胎發(fā)育中的ER穩(wěn)態(tài)和NTD形成中是關(guān)鍵的[27]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和caspase 8依賴性凋亡在母親糖尿病致NTDs發(fā)生中發(fā)揮重要作用。IR1α信號體介導(dǎo)ER應(yīng)激的促凋亡作用，糖尿病增加腫瘤壞死因子受體1R相關(guān)死亡域(tumor necrosis factor receptor type 1R-associated death domain，TRADD)的表達(dá)。體外TRAD過度表達(dá)在Caspase 3和Caspase 8裂解和凋亡前表現(xiàn)出UPR和ER應(yīng)激。缺乏死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白與死亡域(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)顯性陰性(FADD-DN)突變體體內(nèi)過表達(dá)破壞了糖尿病誘導(dǎo)的IRE1α信號體，阻斷JNK1/2-ASK1通路，減輕糖尿病誘導(dǎo)的凋亡前Bcl-2細(xì)胞線粒體移位、線粒體功能障礙和caspase裂解，抑制了ER應(yīng)激和caspase 8依賴性凋亡，從而預(yù)防NTDs[28]。

4.高同型半胱氨酸血癥

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)是一種以血漿總同型半胱氨酸水平升高為特征的臨床疾病，是NTDs的高風(fēng)險(xiǎn)因素[29-30]。葉酸、維生素B6和B12是Hcy代謝中重要的膳食輔因子，這些營養(yǎng)素血漿水平下降與HHcy有關(guān)；發(fā)展中國家以上維生素普遍缺乏，可能是這些國家HHcy和NTDs發(fā)病率增高的原因。

HHcy會增加UPR[31]。HHcy已被證明誘導(dǎo)ER應(yīng)激肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌。動物實(shí)驗(yàn)采用小鼠腦和原代人/小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞模型顯示HHcy可以抑制自噬，并且是與增加的mTOR溶酶體信號有關(guān)。溶酶體膜蛋白LAMP2、空泡ATPase(ATP6V0A2)和蛋白酶組織蛋白酶D降低，提示溶酶體功能障礙也參與了自噬缺陷。通過補(bǔ)充維生素B可以恢復(fù)自噬通量，減輕ER應(yīng)激，并逆轉(zhuǎn)HHcy引起的溶酶體功能障礙。HHcy抑制自噬可加重缺氧缺糖再灌注和氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞損傷。

5.肌醇和PI3K/Akt/GSK-3β通路基因突變

補(bǔ)充肌醇可以預(yù)防NTDs[32-33]和妊娠期糖尿病[34]，可能與TRAD參與IRE1α信號體并誘導(dǎo)UPR和ER應(yīng)激有關(guān)[28]。PI3K/Akt/GSK3β是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖等活動，通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)激活的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-κB、FoxO、mTOR、Par-4、P21等，從而影響細(xì)胞的增殖或凋亡。抑制糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)信號可以抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡[35-36]。動物實(shí)驗(yàn)提示PI3K/Akt/GSK3β通路上多個(gè)基因的變異影響神經(jīng)管閉合。果蠅胚胎中PVR基因突變導(dǎo)致胚胎背中線閉合缺陷[37]，雞胚中PI3K、PDGFR基因突變導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育異常[38]和脊柱裂[39]。TCTN3、SPECC1L、GRHL2、GRHL3、LAMC2、FGF19基因敲除小鼠模型細(xì)胞凋亡增加、粘附連接作用改變導(dǎo)致NTDs[40-43]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)通過刺激PI3K/Akt/GSK3β/β-連環(huán)素途徑，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(數(shù)目、體細(xì)胞大小和平均突起長度)和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[44]。PI3K/Akt/GSK3β通路激活可以通過直接調(diào)節(jié)谷氨酸介導(dǎo)的Bcl-2/Bax失衡來達(dá)到神經(jīng)保護(hù)[45]；也可以通過直接或間接影響轉(zhuǎn)錄因子家族(FoxO、NF-κB、p53等)發(fā)揮細(xì)胞存活調(diào)控作用；增強(qiáng)PI3K/Akt/GSK3β信號通路，可以抑制MPP+激活JNK通路，減少細(xì)胞凋亡[46]。

四、展望

未折疊蛋白反應(yīng)是一種早期的針對外界環(huán)境因素的應(yīng)激反應(yīng)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，外界環(huán)境刺激加劇以及時(shí)間延長，UPR會失去作用并啟動其他生物效應(yīng)如細(xì)胞自噬、凋亡等。氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、caspase 8依賴性細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬等通路與NTDs發(fā)生有關(guān)。但是仍舊有些問題不明確：不同應(yīng)激條件下，啟動不同信號通路致畸的關(guān)鍵因素是什么？NTDs發(fā)生中蛋白合成異常與UPR的關(guān)系如何？UPR啟動及發(fā)揮作用的關(guān)鍵標(biāo)志物和時(shí)點(diǎn)如何測量？從UPR信號通路的角度來探討外環(huán)境暴露導(dǎo)致NTDs發(fā)生的作用機(jī)制，對于尋找NTDs早期生物標(biāo)志物及干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。