固態(tài)發(fā)酵食醋中污染菌的控制研究綜述

程 曄

（貴陽味莼園食品股份有限公司，貴州 惠水 550601）

引起固態(tài)發(fā)酵食醋產(chǎn)品在貨架期間出現(xiàn)黏稠性沉淀物、產(chǎn)氣、醋液呈不同程度的渾濁和發(fā)黏，嚴(yán)重的還會(huì)使產(chǎn)品產(chǎn)生惡臭的污染菌膜很難殺滅和根除。受這種雜菌污染的產(chǎn)品只要出現(xiàn)一批，就會(huì)使數(shù)批甚至數(shù)年，每年春末到初秋時(shí)段的醋產(chǎn)品受到影響。這種情況并非個(gè)例而是存在于絕大多數(shù)固態(tài)發(fā)酵食醋生產(chǎn)企業(yè)，危害極大。

對(duì)于引起食醋在貨架期產(chǎn)氣、渾濁、有異味等變質(zhì)現(xiàn)象的研究已超過20年，參與研究的有工廠、高校、科研院所。研究中被企業(yè)廣為采納的結(jié)論是[1-3]：生醋應(yīng)及時(shí)加熱滅菌；最終醋產(chǎn)品的滅菌法采用高溫一次滅菌法或二次滅菌法；加強(qiáng)生產(chǎn)過程的衛(wèi)生管理，防止交叉污染。

目前研究中存在不足的是不能準(zhǔn)確地解釋食醋發(fā)酵生產(chǎn)中僅在夏季高溫時(shí)節(jié)出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象；沒有一個(gè)適用性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法及生產(chǎn)全過程的有效控制方法，食醋釀造行業(yè)內(nèi)研究者難以從中獲得一致性指導(dǎo)建議。

1 固態(tài)發(fā)酵食醋中菌膜的傳統(tǒng)認(rèn)知

肉眼觀察到的固態(tài)發(fā)酵食醋中的膜狀物，形態(tài)像醋蛾子或紅茶菌膜的碎塊。醋蛾子中最主要的成分是膠膜醋酸桿菌，也就是醋酸菌。紅茶菌膜是多種醋酸菌、酵母菌和乳酸菌組成的“共生菌落”[4-5]。用醋蛾子釀醋法在民間由來已久，其中醋蛾子的主要成分是膠膜醋酸桿菌。膠膜醋酸桿菌又名膜醋酸菌、木醋酸菌，也是紅茶菌中厚膜的主要成分。這種菌膜在釀制白醋工業(yè)中也有應(yīng)用。

1.1 醋蛾子在表面發(fā)酵法釀制白醋生產(chǎn)中的應(yīng)用

釀造食醋生產(chǎn)工藝分為固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵兩大類，液態(tài)發(fā)酵釀醋工藝中又分為表面發(fā)酵法、淋澆發(fā)酵法、深層發(fā)酵法和固定化菌體連續(xù)發(fā)酵法。其中表面發(fā)酵法生產(chǎn)白醋[6]是在敞口容器中置醋種（上批的成熟醋），加入體積分?jǐn)?shù)3%的酒液及少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，蓋上缸蓋，在自然氣溫或在30 ℃左右的保溫室內(nèi)自然發(fā)酵，此時(shí)醋酸菌在液面上形成一層菌膜。

日本最普遍采用的釀醋方法[7]按發(fā)酵形式可分為靜置式和通氣式兩種。靜置式釀醋法以米醋制法為例，米飯加曲糖化后進(jìn)行酒精發(fā)酵，再加入醋酸菌、醋化桿菌等菌培養(yǎng)的醋母，在方形罐中靜置發(fā)酵3～4 d，液面形成一層菌膜，開始生成醋酸。

1.2 釀造食醋的滅菌方法

食醋的pH值為2.8～3.8，屬高酸食品，只要總酸≥3.5 g/100 mL，食醋中微生物80 ℃、10 min加熱滅菌即可達(dá)到要求。即便是污染菌膜，鑒于對(duì)食醋中污染菌膜的傳統(tǒng)認(rèn)知，認(rèn)為這種菌膜是醋酸菌、酵母菌和乳酸菌的共生菌，其致死溫度和時(shí)間為50～65 ℃、10 min，食醋的常規(guī)滅菌溫度和時(shí)間為80 ℃、10 min，是能達(dá)到GB 2719—2018《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB18187—2000《釀造食醋》中微生物指標(biāo)要求的。

1.3 企業(yè)對(duì)固態(tài)醋酸發(fā)酵中污染菌膜的微生物檢測(cè)方法

取變質(zhì)醋樣采用傳統(tǒng)的增殖培養(yǎng)，將增殖培養(yǎng)的菌液用傾注法接種于不同的平板培養(yǎng)基中，進(jìn)行厭氧或好氧培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，再經(jīng)染色法和顯微鏡法，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行初步分類，分析判斷污染細(xì)菌的種屬，進(jìn)而推斷出該類菌的生長(zhǎng)和致死條件。

產(chǎn)品出廠的食醋微生物檢驗(yàn)均按照GB 4789.1—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》、GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》和GB/T4789.22—2003《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)調(diào)味品檢驗(yàn)》微生物檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4 傳統(tǒng)認(rèn)知對(duì)食醋中污染菌膜的檢驗(yàn)與控制的不適用性

（1）實(shí)踐證明巴氏滅菌法不能殺滅食醋中污染菌膜。

（2）傳統(tǒng)的微生物分離鑒定法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且在培養(yǎng)基上很難得到疑似單一菌株，也就無從進(jìn)一步進(jìn)行其生長(zhǎng)特性及致死條件的試驗(yàn)。

（3）采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的微生物檢驗(yàn)方法，檢驗(yàn)已變質(zhì)的醋樣，結(jié)果仍無法判斷變質(zhì)醋的微生物指標(biāo)不合格。檢驗(yàn)結(jié)果一般均符合GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB 18187—2000《釀造食醋》中微生物指標(biāo)要求。其中菌落總數(shù)幾乎都≤100 CFU/mL，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的≤10 000 CFU/mL。

2 固態(tài)發(fā)酵食醋中污染菌的研究

由于傳統(tǒng)認(rèn)知對(duì)食醋中污染菌的檢驗(yàn)與控制方法的不適用性，食醋中引起黏度增加、產(chǎn)氣、變質(zhì)、拉絲、產(chǎn)膜的污染菌對(duì)釀醋行業(yè)的危害長(zhǎng)期存在，一直是企業(yè)質(zhì)量控制中的一個(gè)難題。這個(gè)課題也引起了高校及科研院所的關(guān)注，課題研究報(bào)告不少，但研究結(jié)論不一致，缺乏指導(dǎo)性結(jié)論。

2.1 固態(tài)發(fā)酵食醋被雜菌污染的關(guān)鍵生產(chǎn)環(huán)節(jié)研究

馬凈麗等[1，3]研究得出，生醋的長(zhǎng)時(shí)間存放是引起污染菌的主要原因。通過對(duì)生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)了解，車間在固態(tài)醋酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中，確有生醋長(zhǎng)時(shí)間存放的現(xiàn)象，由于固態(tài)醋酸發(fā)酵工藝所決定，生醋中還原糖和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物豐富，并有少量殘留乙醇，在存放過程中，存活的微生物中部分耐酸厭氧菌，利用其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在醋液底部至中上部繼續(xù)繁殖，耐酸好氧菌或兼性好氧菌則可在表面繁殖，其中的產(chǎn)酸菌可將醋液中的糖轉(zhuǎn)化為酸，單從以產(chǎn)酸含量判斷原料利用率，短時(shí)表象有益無害，可多批生醋連續(xù)存放后，難免就形成了與雜菌共生而變異的醋蛾子。由于現(xiàn)在具有一定規(guī)模的食醋生產(chǎn)企業(yè)，待配兌或待滅菌的生醋都是存放在容積幾十至上百立方米的大罐中，進(jìn)罐出罐的醋對(duì)液面的沖擊，可在罐底找到像醋蛾子或紅茶菌膜碎塊的膜狀物，醋液發(fā)黏、有納豆的拉絲。

2.2 引起固態(tài)發(fā)酵食醋發(fā)黏、產(chǎn)氣變質(zhì)的微生物菌屬研究

對(duì)于食醋中微生物污染菌的研究，分離鑒定的方法不同，樣品的差異，研究結(jié)果也不一致。在9個(gè)研究報(bào)告中，得出導(dǎo)致食醋腐敗變質(zhì)的污染菌有8種不同的結(jié)論：鑒定為芽孢桿菌（Bacillus）2例；鑒定為類芽孢桿菌（Paenibacillus）1例；鑒定為葡糖桿菌屬（Gluconobacter）1例；鑒定為牛痘乳桿菌（Lactobacillus vaccinostercus）1例；鑒定為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）1例；鑒定分別為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、腐生葡萄球菌（Staphalococcus saprophyticus）、頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1例；鑒定分別為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）1例；鑒定為引起腐敗現(xiàn)象的致腐微生物是以穩(wěn)定群落的形式存在1例。

2.2.1 采用傳統(tǒng)分離鑒定方法判定污染菌的研究

王建云等[2]對(duì)發(fā)黏、劣變的食醋采用常規(guī)平板培養(yǎng)法37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，鏡檢后判定污染菌為芽孢桿菌。成劍鋒[3]對(duì)變質(zhì)食醋中的膜狀物洗液，采用肉胨培養(yǎng)基30 ℃室溫培養(yǎng)，對(duì)單一菌落進(jìn)行芽孢染色、鞭毛染色后鏡檢，接觸酶試驗(yàn)，再對(duì)照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步判定為污染菌為類芽孢桿菌屬。張懷敏等[9]對(duì)導(dǎo)致老陳醋產(chǎn)氣微生物的分離和鑒定中得到1株革蘭氏陽性菌，經(jīng)產(chǎn)氣性、生理生化試驗(yàn)，并根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》判斷得出，產(chǎn)氣菌株為芽孢桿菌。薛建華等[10]通過液體富集培養(yǎng)、平板涂布及劃線的方式，結(jié)合驗(yàn)證試驗(yàn)，從食醋中分離出絮狀物的產(chǎn)生菌，初步鑒定為葡糖桿菌屬。

2.2.2 采用傳統(tǒng)分離鑒定方法與16S rDNA 序列分析方法判定污染菌的研究

孫文麗等[11]從脹氣食醋中分離到6株細(xì)菌，經(jīng)鑒定分別為貝萊斯芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、腐生葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。且各菌株均可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生白色絮狀物沉淀，其中1株菌能產(chǎn)生氣體，是造成食醋脹氣的主要潛在微生物。曹晉宜等[12]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)與16S rDNA 序列同源性分析方法，并結(jié)合微生物宏基因組分類測(cè)序方法得出了引起食醋發(fā)黏的微生物主要是牛痘乳桿菌的結(jié)論。翟磊等[13]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)以及純培養(yǎng)技術(shù)，得到導(dǎo)致食醋變質(zhì)污染菌株，通過分子生物學(xué)分析鑒定污染菌為耐酸乳桿菌。趙爽等[14]從產(chǎn)膜醋中分離的菌株，進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA鑒定，結(jié)果證實(shí)，引起食醋產(chǎn)膜的菌株為木葡糖醋酸桿菌和巴氏醋桿菌。楊榮杰[15]根據(jù)形態(tài)特征觀察及生理生化鑒定結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中對(duì)芽抱桿菌的特征描述進(jìn)行初步分類；16S rDNA序列測(cè)定與分析結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌可以導(dǎo)致食醋產(chǎn)膜、變渾濁。范曉軍[16]利用Illumina HiSep高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)山西老陳醋夏冬兩季不同發(fā)酵階段的細(xì)菌菌群構(gòu)成及演替進(jìn)行深入分析，首次發(fā)現(xiàn)引起食醋腐敗現(xiàn)象的致腐微生物以穩(wěn)定群落的形式存在。

2.2.3 研究得出引起變質(zhì)的污染菌中多數(shù)是固態(tài)醋酸發(fā)酵中的常見菌

有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17-20]，乳酸菌、醋酸菌是主要的食醋釀造微生物，芽孢桿菌也是固態(tài)醋酸發(fā)酵中的常見菌。在多個(gè)地區(qū)的固態(tài)醋酸發(fā)酵醋醅中分離出巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌。研究表明[20-23]，芽孢桿菌是固態(tài)醋酸發(fā)酵過程中的重要微生物，芽孢桿菌在其體內(nèi)不僅存在糖酵解途徑，而且存在三羧酸循環(huán)的氧化代謝途徑，其中間代謝產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸的存在，可以緩解揮發(fā)性醋酸的刺激氣味。凝結(jié)芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中可以產(chǎn)生乳酸，對(duì)食醋提高風(fēng)味也是必不可少的[24-25]。固態(tài)開放式發(fā)酵過程中復(fù)雜的微生物代謝賦予了固態(tài)發(fā)酵食醋獨(dú)特的風(fēng)味及口感，但是對(duì)復(fù)雜微生物群落的釀造功能及其調(diào)控方法尚缺少深入了解。

2.3 固態(tài)發(fā)酵食醋中污染菌的檢驗(yàn)方法研究

研究中采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法對(duì)已變質(zhì)的食醋樣品微生物檢測(cè)，菌落總數(shù)幾乎為0。當(dāng)采用血球計(jì)數(shù)版顯微鏡觀察計(jì)數(shù)時(shí)，活動(dòng)菌≥106CFU/mL，不活動(dòng)菌也≥106CFU/mL，其中多為桿菌和短桿菌。國(guó)家制定的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》、《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》和《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)調(diào)味品檢驗(yàn)》檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)已不適用于食醋出廠檢驗(yàn)。

張繼忠等[26-27]對(duì)我國(guó)食品微生物檢測(cè)技術(shù)的分析中也證實(shí)了這個(gè)論點(diǎn)，國(guó)家制定的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法已經(jīng)無法很好地適應(yīng)當(dāng)前的實(shí)際檢測(cè)需求，在這一背景下，必須要提高檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)新突破。

在2.2中引起固態(tài)發(fā)酵食醋發(fā)黏、產(chǎn)氣變質(zhì)的微生物菌屬研究中，已介紹了研究中所采用的檢測(cè)方法。無論何種方法，首先得采用傳統(tǒng)的分離鑒定法得到單一菌株?？墒窃谄髽I(yè)的驗(yàn)證試驗(yàn)中，即便是已經(jīng)出現(xiàn)發(fā)黏、渾濁、產(chǎn)氣的食醋樣品，都很難獲得疑似菌落，因?yàn)槟承┪⑸镂锓N難以培養(yǎng)和分離，并且完全依賴于微生物的表型性狀也會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的識(shí)別[28-30]。

2.4 固態(tài)發(fā)酵食醋中污染菌的控制方法研究

對(duì)污染菌實(shí)施控制的是企業(yè)，要制定一套完整、有效的生產(chǎn)全過程控制方法，主要依據(jù)是污染菌的定性、定量檢測(cè)結(jié)果。準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果又必須建立在可信的檢驗(yàn)方法上，鑒于目前雖有許多新技術(shù)在微生物檢測(cè)上的成功應(yīng)用報(bào)道，但都還是研究層面上的，尚無企業(yè)適用的檢驗(yàn)方法。只能采用生醋應(yīng)及時(shí)加熱滅菌；最終醋產(chǎn)品的滅菌法采用高溫一次滅菌法或二次滅菌法；加強(qiáng)生產(chǎn)過程的衛(wèi)生管理，防止交叉污染的研究結(jié)論[1，3]。對(duì)目前防止固態(tài)發(fā)酵食醋產(chǎn)品貨架期出現(xiàn)發(fā)黏、產(chǎn)氣、渾濁等質(zhì)量問題起到一定作用。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，目前對(duì)固態(tài)發(fā)酵食醋中污染菌的研究，初步認(rèn)定可能導(dǎo)致固態(tài)發(fā)酵食醋發(fā)黏、產(chǎn)氣、渾濁的污染菌是以穩(wěn)定群落的形式存在，其中的菌屬有醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。

這些菌在固態(tài)發(fā)酵食醋中對(duì)食醋的理化、風(fēng)味質(zhì)量是有益的。也正因?yàn)榘l(fā)酵過程中微生物的多樣性，在生醋中存活的微生物也是多樣性的，如果不及時(shí)滅菌存放，在營(yíng)養(yǎng)豐富的液態(tài)低pH值環(huán)境下是否會(huì)產(chǎn)生變異，聚集形成危害食醋產(chǎn)品的雜菌菌膜，尚待深入研究。

上述研究對(duì)食醋生產(chǎn)一線的傳統(tǒng)認(rèn)知起到了一定的警示作用，杜絕了生醋的長(zhǎng)時(shí)間存放，采用高溫滅菌或二次滅菌法取代了傳統(tǒng)巴氏滅菌法，加強(qiáng)生產(chǎn)過程的衛(wèi)生管理，防止交叉污染。

存在的不足是研究結(jié)論不一致，食醋釀造行業(yè)內(nèi)研究者難以從中獲得一致性指導(dǎo)建議。研究中介紹的檢驗(yàn)方法還停留在研究層面，沒有一個(gè)對(duì)企業(yè)適用性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法及生產(chǎn)全過程的有效控制方法。

在今后的研究中綜合各種食品微生物檢驗(yàn)新技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，不斷優(yōu)化組合，研究出更快、更方便、更靈敏的固態(tài)發(fā)酵食醋中污染菌的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。