EP方案化療對(duì)廣泛期小細(xì)胞肺癌CTCs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響的初步研究

劉書斌 孫暉 薛小燕 曾淦華 黃慧玲 賴景春 許辰陽 祝偉

【摘要】 目的：研究EP方案化療對(duì)廣泛期小細(xì)胞肺癌（ED-SCLC）患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法：將2016年10月-2017年12月贛州市人民醫(yī)院收治的76例符合入組條件的ED-SCLC受試者作為本研究對(duì)象，采集分離獲得ED-SCLC受試者外周靜脈血中CTCs，運(yùn)用密度梯度離心法和流式細(xì)胞術(shù)富集分析化療前后CTCs數(shù)目及細(xì)胞表型情況;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）分析化療前后細(xì)胞角蛋白-19（CK-19）、鈣離子依賴型細(xì)胞黏附素家族（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的mRNA相對(duì)陽性表達(dá)情況及其變化情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定CK-19、E-cadherin及Vimentin蛋白水平變化情況。結(jié)果：用EP方案化療后的ED-SCLC患者的CTCs計(jì)數(shù)與陽性表達(dá)例數(shù)較化療前均明顯降低（P<0.05）;CK-19、E-cadherin的mRNA相對(duì)陽性表達(dá)率較化療前均明顯降低，而Vimentin的mRNA相對(duì)陽性表達(dá)率較化療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?；颊逧-cadherin、Vimentin蛋白水平較化療前均明顯降低，而CK-19蛋白水平較化療前升高（P<0.05）。結(jié)論：ED-SCLC患者采用EP方案化療后可能通過抑制CTCs發(fā)生EMT過程，進(jìn)而產(chǎn)生抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移效果，這對(duì)進(jìn)一步明確SCLC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移之間的量化對(duì)應(yīng)關(guān)系及患者個(gè)體化治療均有積極意義。

【關(guān)鍵詞】 廣泛期小細(xì)胞肺癌 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 EP方案

[Abstract] Objective： To study the effect of EP regimen on epithelial-mesenchymal transition （EMT） in peripheral blood circulating tumor cells （CTCs） in patients with extensive stage small cell lung cancer （ED-SCLC）. Method： Seventy-six ED-SCLC subjects who met the enrollment criteria admitted to the Peoples Hospital of Ganzhou City from October 2016 to December 2017 were included in the study. The venous venous blood was collected from ED-SCLC subjects. CTCs were enriched by density gradient centrifugation and flow cytometry to analyze the number of CTCs and cell phenotypes in patients before and after chemotherapy. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to analyze cytokeratin-19 （CK-19） before and after chemotherapy， the relative positive expression of mRNA of calcium-dependent cell adhesin family （E-cadherin） and Vimentin and their changes. The levels of CK-19， E-cadherin and Vimentin protein were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Result： The number of CTCs and positive expression in ED-SCLC patients treated with EP regimen were significantly lower than those before chemotherapy （P<0.05）. The relative positive expression rates of CK-19 and E-cadherin mRNA were significantly lower than those of before chemotherapy， the relative positive expression rate of Vimentin mRNA was higher than that of before chemotherapy， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The protein levels of E-cadherin and Vimentin were significantly lower than those of before chemotherapy， while the level of CK-19 protein was higher than that of before chemotherapy （P<0.05）. Conclusion： ED-SCLC patients may have EMT by inhibiting CTCs in patients after chemotherapy with EP regimen， and then has the effect of inhibiting tumor recurrence and metastasis. The process has positive implications for further clarifying the quantitative correspondence between SCLC recurrence and metastasis and individualized treatment of patients.

[Key words] Extensive small cell lung cancer Circulating tumor cells Epithelial-mesenchymal transitionEP protocol

First-authors address： Peoples Hospital of Ganzhou City， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.32.039

肺癌是一種由于飲食結(jié)構(gòu)改變、吸煙及二手煙等因素影響而病死率極高的惡性腫瘤，肺癌的發(fā)病率和死亡率均逐年攀升，目前世界大部分國家腫瘤死亡的原因中肺癌居首位。肺癌按照組織病理學(xué)劃分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）與小細(xì)胞肺癌（SCLC）兩大種類。其中SCLC是一種以生長(zhǎng)速度快、惡性程度高、早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移及高度侵襲性為特征的肺癌，該種肺癌發(fā)病率占原發(fā)性肺癌的20%～25%，其又可分為局限期（LD-SCLC）和廣泛期（ED-SCLC）[1-2]。其中LD-SCLC患者采用放化療為主的綜合治療，而ED-SCLC患者主要以EP方案或IP方案化療為主，放射治療為輔。但ED-SCLC早期出現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移，對(duì)化療敏感，治療后患者有60%～80%的客觀緩解率，但90%ED-SCLC患者在短期內(nèi)會(huì)出現(xiàn)肺癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，2年生存率低于5%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[3]?，F(xiàn)有研究，EP方案在一定程度上可以控制SCLC的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，但具體分子機(jī)制不明確[4]。本研究旨在探究EP方案化療對(duì)ED-SCLC患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）影響，初步闡述其中分子機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月-2017年12月贛州市人民醫(yī)院收治的76例符合入組條件的ED-SCLC受試者為本研究對(duì)象。其中男48例，女28例，年齡38～67歲，平均（53.2±7.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》（2018年版）中SCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];經(jīng)醫(yī)院組織病理學(xué)確診為ED-SCLC;各項(xiàng)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神疾病，伴有嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙;合并嚴(yán)重心腎功能不全癥狀;合并其他惡性腫。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)實(shí)施，入選患者及其家屬均知情同意并簽訂知情協(xié)議書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 ED-SCLC受試者采用依托泊苷聯(lián)合順鉑（EP）方案予以治療：第1～3天靜脈滴注依托泊苷（生產(chǎn)廠家：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H32025583，規(guī)格：5 mL︰0.1 g）120 mg/m2和順鉑（生產(chǎn)廠家：南京制藥廠有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20103216，規(guī)格：20 mL︰20 mg）25 mg/m2治療。共治療3個(gè)周期，21 d為一周期，療程結(jié)束后評(píng)估療效。

1.2.2 CTCs分選與計(jì)數(shù) 利用嚴(yán)格消毒后真空采血針采集ED-SCLC患者化療前及化療后1、3、24、48、72 h及5 d的外周靜脈血5～10 mL，迅速加入5 mL人淋巴細(xì)胞分離液，取5 mL肝素抗凝靜脈血與等量磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋混勻，并將稀釋液緩慢加入人淋巴結(jié)細(xì)胞分離液上層。離心20 min（4 000 r/min），隨后可見離心管自下而上出現(xiàn)5層，CTCs位于環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層中，小心吸取并加入5 mL PBS液洗滌2次，再次離心10 min（2 000 r/min），再吸取試管底部細(xì)胞沉積物，置于-196 ℃的液氮中保存。采用免疫熒光染色技術(shù)鑒定CTCs并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 熒光定量PCR法（qRT-PCR）分析mRNA表達(dá)情況 采用qRT-PCR法（BIO-rad CFX96 touch）檢測(cè)富集分離的CTCs相關(guān)基因（CK19、E-cadherin、Vimentin）的相對(duì)表達(dá)情況。將獲取的血液樣本加入1 mL Trizol裂解，200 μL氯仿萃取，75%乙醇洗滌，按照試劑盒說明書提取樣本總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA（各種試劑的固定總量為5.25 μL，再加入1 μg總RNA，用DEPC-H2O補(bǔ)充至10 μL，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA），最后在進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件：90 ℃反應(yīng)30 s，95 ℃反應(yīng)5 s，55 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s。共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min）獲得數(shù)據(jù)。ΔCt=Ct（待檢基因）-Ct（內(nèi)參基因），使用2ΔΔCt法分析比較mRNA的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定蛋白濃度 使用ABclonal公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)角蛋白-19（CK-19），使用Abcam公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)鈣離子依賴型細(xì)胞黏附素家族（E-cadherin），使用Omega公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)波形蛋白（Vimentin），上述檢測(cè)均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作完成。

1.3 觀察指標(biāo)與評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 治療前后外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)及陽性表達(dá)率，治療前后CK-19、E-cadherin及Vimentin的mRNA表達(dá)量，治療結(jié)束后的臨床療效。按照實(shí)體瘤療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)治療效果，完全緩解（CR）：目標(biāo)病灶消失且情況穩(wěn)定維持4周;部分緩解（PR）：目標(biāo)基線病灶最大直徑總和下降30%且情況穩(wěn)定維持4周;穩(wěn)定（SD）;目標(biāo)基線病灶最大直徑總和下降小于30%;進(jìn)展（PD）：目標(biāo)基線病灶加重。臨床有效率=（CR例數(shù)+PR例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后CTCs計(jì)數(shù)及細(xì)胞表型比較 ED-SCLC患者采用EP方案化療后，CTCs計(jì)數(shù)及陽性表達(dá)率較治療前均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 治療前后CK-19、E-cadherin、Vimentin的mRNA陽性表達(dá)情況比較 EP方案化療后CK-19、E-cadherin的mRNA陽性表達(dá)率均較化療前明顯降低，而Vimentin的mRNA陽性表達(dá)率較化療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 治療前后CK-19、E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)水平比較 EP方案化療后E-cadherin、Vimentin蛋白水平較化療前均明顯降低，而CK-19蛋白水平較化療前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 臨床療效 應(yīng)用EP方案化療ED-SCLC患者，療程結(jié)束后，CR 6例、PR 40例、SD 18例、PD 12例，臨床有效率為60.5%，EP方案化療對(duì)ED-SCLC腫瘤有確切效果。

3 討論

肺癌是一類常見的嚴(yán)重威脅人們生活質(zhì)量及生命健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率隨著環(huán)境的惡化正在逐年攀升。肺癌按照組織病理學(xué)劃分為NSCLC與SCLC兩類，其中SCLC是以生長(zhǎng)速度快、惡性程度高、早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移及高度侵襲性為特征的肺癌，雖其對(duì)放療與化療敏感，但目前EP方案仍是臨床救治SCLC的一線方法，多項(xiàng)研究證實(shí)其對(duì)SCLC有確切療效[6-7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)SCLC患者尤其是ED-SCLC患者，外周血中CTCs數(shù)量遠(yuǎn)超過其他腫瘤類型的CTCs計(jì)數(shù)，表明CTCs可能有不同于其他細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)。CTCs是自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放而進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，相關(guān)研究表明CTCs形成是腫瘤進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的首要因素，在腫瘤的血行播散中起著重要的作用[8-9]。伴隨現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，目前CTCs檢測(cè)方法的敏感度和特異度不斷提高，并且在其臨床應(yīng)用價(jià)值逐漸得到人們的重視。

EMT是指帶有極性上皮細(xì)胞在特定生理或病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化變成間質(zhì)細(xì)胞的過程，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)CTCs在EMT發(fā)揮了重要作用，EMT使CTCs間質(zhì)化從而賦予了上皮腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，參與了腫瘤異質(zhì)性的形成和轉(zhuǎn)移過程[10-11]。EMT發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞喪失極性，與周圍細(xì)胞及基質(zhì)接觸減少，從而降低了細(xì)胞間的黏附作用，使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力加強(qiáng);此外EMT導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生改變，特征性表現(xiàn)為Vimentin、Fibronectin等間質(zhì)型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)而E-cadherin、Cytokeratin等上皮型標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)或缺失[12]。CK-19是一種上皮組織特異性標(biāo)記物，為上皮特異性分布蛋白質(zhì)，而非上皮組織來源的細(xì)胞、淋巴結(jié)均不表達(dá)，因此CK-19可作為腫瘤患者血中是否存在CTCs微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志[13]。E-cadherin主要位于上皮細(xì)胞的緊密連接處，其表達(dá)的減少和缺失可引起細(xì)胞間粘連的改變，使得細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，引發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimemin對(duì)判斷CTCs的轉(zhuǎn)化特征具有重要意義，其表達(dá)高提示CTCs獲得了間質(zhì)細(xì)胞的特性，侵襲和移動(dòng)性大幅增強(qiáng)[15-16]。這些細(xì)胞表型的變化為證實(shí)EMT的存在提供了契機(jī)，通過檢測(cè)其變化情況可以判定是否發(fā)生EMT。從而推測(cè)EP方案化療是否會(huì)對(duì)ED-SCLC患者CTCs的EMT過程產(chǎn)生影響，進(jìn)一步證實(shí)EP方案化療是否通過抑制CTCs發(fā)生EMT過程，從而抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[17-19]。

本研究結(jié)果顯示，在EP方案化療后，CK-19、E-cadherin的mRNA陽性表達(dá)率均降低，而Vimentin的mRNA的陽性表達(dá)率升高，提示ED-SCLC患者CTCs中存在有上皮亞型、間質(zhì)亞型以及發(fā)生上皮-間質(zhì)或間質(zhì)-上皮亞型的轉(zhuǎn)變，表明EP方案化療可能通過抑制ED-SCLC患者CTCs發(fā)生EMT過程，從而抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，EP方案化療可通過抑制ED-SCLC患者CTCs發(fā)生EMT過程，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，這對(duì)了解化療藥物在惡性腫瘤治療中的具體分子機(jī)制、明確化療在CTCs發(fā)生EMT過程的意義和地位均具有積極意義;與此同時(shí)，臨床早期監(jiān)測(cè)CTCs變化可能對(duì)發(fā)現(xiàn)腫瘤、腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要意義。本研究也為CTCs與腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移之間的量化對(duì)應(yīng)關(guān)系、闡明肺癌具體機(jī)制提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-08-21） （本文編輯：程旭然）