陽(yáng)江地區(qū)兒童貧血情況及相關(guān)基因檢測(cè)調(diào)查結(jié)果分析

陳文鋒 李樺

【摘要】 目的：探討陽(yáng)江地區(qū)兒童貧血情況，并記錄其相關(guān)基因檢測(cè)調(diào)查結(jié)果。方法：選取2015年4月-2017年4月本院兒科門診以及兒童保健科收治的貧血患兒2 000例為研究對(duì)象，采用PCR聯(lián)合導(dǎo)流雜交法檢測(cè)兒童貧血情況，進(jìn)一步分析基因組成情況。結(jié)果：2 000例貧血患兒中，篩查出1 296例（64.80%）地貧基因攜帶者，其中α地貧689例（53.16%），β地貧562例（43.36%），α復(fù)合β地貧45例（3.47%）;689例α地貧患兒中，靜止型α地貧68例，輕型α地貧602例，中間型α地貧19例，以-α3.7/αα、--SEA/αα、--SEA/-α3.7等基因型為主;562例β地貧患兒中，β+/βN、β0/βN、β+/β+、β+/β0、β0/β0基因型分別有208、324、6、16、8例，以IVS-2-654/N、CD17/N、CD41-42/N等基因型為主;45例α復(fù)合β地貧患兒中，輕型α復(fù)合β地貧33例、中間型α復(fù)合β地貧4例、重型α復(fù)合β地貧8例，以CD41-42/N+-α3.7/αα、CD41-42/N+--SEA/αα、IVS-2-654/N+-α3.7/αα等基因型為主。結(jié)論：陽(yáng)江地區(qū)兒童地中海貧血發(fā)生率高，α地貧中-α3.7/αα、--SEA/αα、--SEA/-α3.7等基因型較為常見，β地貧中IVS-2-654/N、CD17/N、CD41-42/N等基因型較為常見，α復(fù)合β地貧較少，基因型調(diào)查對(duì)于地中海貧血的治療、診斷及預(yù)防具有重要意義，具有臨床推廣價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 陽(yáng)江地區(qū) 兒童 地中海貧血 基因檢測(cè)

[Abstract] Objective： To investigate the anemia of children in Yangjiang area and record the results of related gene detection. Method： From April 2015 to April 2017， 2 000 children with anemia in Pediatric Clinic and Childrens Health Care Department of our hospital were selected as the research objects. The anemia status of children was detected by PCR combined with shunt hybridization， and the genome composition was further analyzed. Result： Among 2 000 children with anemia， 1 296 cases （64.80%） were screened out as carriers of thalassemia gene， 689 cases （53.16%） were α thalassemia， 562 cases （43.36%） were β thalassemia and 45 cases （3.47%） were α complex β thalassemia. Among 689 patients with α thalassemia， 68 cases were stationary type， 602 cases were light type and 19 cases were intermediate type， the main genotypes were -α3.7/αα， --SEA/αα， --SEA/-α3.7. Among 562 children with β thalassemia， there were 208 cases， 324 cases， 6 cases， 16 cases and?8 cases genotypes of β+/βN， β0/βN， β+/β+， β+/β0， β0/β0， respectively. The main genotypes were IVS-2-654/N， CD17/N， CD41-42/NIVS-2-654/N， CD17/N and CD41-42/N. Among 45 children with α complex β thalassemia，?33 cases were mild， 4 cases were intermediate， 8 cases were heavy type. The main genotypes were CD41-42/N+-α3.7/αα， CD41-42/N+--SEA/αα， IVS-2-654/N+-α3.7/αα. Conclusion： The incidence of thalassemia in children in Yangjiang area is high. The genotypes of α thalassemia are relatively common， such as -α3.7/αα， --SEA/αα， --SEA/-α3.7， IVS-2-654/N， CD17/N， CD41-42/N are relatively common in β thalassemia， and α complex β thalassemia is relatively rare. Genotype investigation is of great importance in the treatment， diagnosis and prevention of thalassemia. It is of great significance and has a clinical popularization value.

[Key words] Yangjiang area Children Thalassemia Gene detection

First-authors address： Yangjiang Maternal and Child Health Hospital， Yangjiang 529500， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.32.019

地中海貧血是臨床常見的染色體隱性單基因遺傳病，是因基因缺失或突變導(dǎo)致珠蛋白合成障礙引起，臨床簡(jiǎn)稱地貧，對(duì)合成障礙的珠蛋白分析發(fā)現(xiàn)，α地中海貧血和β地中海貧血是其主要類型，多見于地中海、東南亞地區(qū)，地貧是一種單基因遺傳病，當(dāng)前尚未有特效方式治療[1]。α地中海貧血分為缺失型與非缺失型，而在我國(guó)缺失型較為常見[2]。β地中海貧血突變類型較多，在全世界發(fā)現(xiàn)的160多種中，中國(guó)檢測(cè)出22種，少數(shù)核苷酸的置換、插入、缺失造成基因表達(dá)水平低甚至不表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)功能mRNA，經(jīng)過(guò)一系列加工翻譯后則會(huì)合成不穩(wěn)定的珠蛋白鏈，誘發(fā)地貧[3]。地貧嚴(yán)重威脅小兒的健康及生命，部分重癥型患兒需給予規(guī)范化輸血聯(lián)合去鐵治療來(lái)維持生命，因此預(yù)防、避免地貧患兒的出生是地貧預(yù)防工作的重點(diǎn)[4]。有研究提出，我國(guó)華南地區(qū)α、β地貧總的基因攜帶率在8%～10%，廣東省人群中α、β地貧總的基因攜帶率高達(dá)11.07%[5]。此次研究通過(guò)對(duì)本院兒科門診以及兒童保健科兒童進(jìn)行貧血檢查，旨在探討陽(yáng)江地區(qū)兒童地中海貧血的常見基因類型，為臨床治療、預(yù)防提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年4月-2017年4月本院兒科門診以及兒童保健科收集的2 000例患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒家屬均自愿讓患兒參與本項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：一般資料不完整。其中男1 076例，女924例;年齡51 d～13歲，平均（6.59±1.25）歲。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常：平均紅細(xì)胞血紅蛋白MCH<27 pg;紅細(xì)胞體積MCV<82 fl;Hb電泳檢查，HbA2≤2.5%或≥3.5%或HbA2指標(biāo)正常但HbF≥3%。患兒家屬均簽署本院倫理委員會(huì)出具的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本DNA的提取 向1.5 mL離心管中加入100 μL抗凝全血及800 μL裂紅液，充分混勻后在室溫下放置3 min，8 000 r/min離心2 min，保留管底沉淀，加入DNA抽取試劑，提取樣品中DNA。

1.2.2 α地貧基因檢測(cè) （1）PCR擴(kuò)增：樣品數(shù)為n，選擇n+1管PCR反應(yīng)液，設(shè)定1管為陰性質(zhì)控，在5 000 r/min下離心2 s，將離心液轉(zhuǎn)移于PCR管中并標(biāo)記，分別加入4 μL提取的待測(cè)樣品DNA，反應(yīng)體系為25 μL。陰性質(zhì)控：加入4 μL純水對(duì)照。依次進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物置于4 ℃下保存。（2）電泳：配制1.0%的瓊脂糖凝膠，并在其中添加適量的熒光染料，取20 μL PCR產(chǎn)物上樣，Markers上樣量為1.5～3.0 μL，在8 V/cm下電泳3 min，隨后調(diào)為5 V/cm電泳1 h，結(jié)束后將瓊脂糖凝膠置入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。（3）讀取結(jié)果：正常：檢測(cè)樣品為1條1 700 bp正常條帶;雙重缺失雜合子：檢測(cè)樣品中無(wú)正常條帶，為2條缺失型條帶;缺失雜合子：檢測(cè)樣品為1條缺失型條帶及1條1 700 bp正常條帶;缺失純合子：檢測(cè)樣品中無(wú)正常條帶，只有1條缺失型條帶。

1.2.3 β地貧基因檢測(cè) （1）PCR擴(kuò)增：樣品數(shù)為n，選擇n+1管PCR反應(yīng)液，設(shè)定1管為陰性質(zhì)控，在5 000 r/min下離心2 s，將離心液轉(zhuǎn)移于PCR管中并標(biāo)記，分別加入2 μL提取的待測(cè)樣品DNA，反應(yīng)體系為25 μL。陰性質(zhì)控：加入2 μL純水對(duì)照。向各管中滴入1滴礦物油后進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物置于4 ℃下保存。（2）雜交：取15 mL塑料離心管放入標(biāo)有編號(hào)的膜條后加入6 mL組成為0.1% SDS，2×SSC，pH為7.4的溶液及PCR產(chǎn)物，在擰緊蓋子時(shí)稍微擰松，避免加熱爆開管蓋，在沸水中加熱10 min后取出并擰緊蓋子置于42 ℃雜交箱中雜交1.5～4 h。向50 mL塑料管中加入40 mL組成為0.1% SDS，0.5×SSC，pH為7.4的溶液，放置在雜交箱中預(yù)熱至42 ℃。（3）洗膜：取出膜條后轉(zhuǎn)移至預(yù)熱管中，并輕搖15 min。（4）顯色：配制相應(yīng)比例的酶標(biāo)液，將洗膜后的膜條置入其中，室溫下浸泡30 min，采用組成為0.1% SDS，0.5×SSC，pH為7.4的溶液洗2次，5 min/次。將膜條放置在顯色液中避光顯色20 min，倒掉顯色液后，用清水沖洗膜條，記錄檢測(cè)結(jié)果。（5）判定結(jié)果：嚴(yán)格參照試劑盒指示，膜條上突變位點(diǎn)有信號(hào)則表示存在該類型突變，在正常對(duì)照上也有信號(hào)則表示為突變雜合子，無(wú)信號(hào)顯示則表示為該類型突變純合子。

2 結(jié)果

2.1 診斷分析 在2 000例貧血患兒中，篩查出1 296例地貧基因攜帶者，檢出率為64.80%（1 296/2 000），其中α地貧689例，占53.16%（689/1 296），β地貧562例，占43.36%（562/1 296），α復(fù)合β地貧45例，占3.47%（45/1 296）。

2.2 α地貧基因類型及比例 689例α地貧患兒中，靜止型α地貧68例，輕型α地貧602例，中間型α地貧19例，主要基因型有-α3.7/αα、--SEA/αα、--SEA/-α3.7，分別占比6.68%、78.96%、6.39%，見表1。

2.3 β地貧基因類型及比例 562例β地貧患兒中，β+/βN、β0/βN、β+/β+、β+/β0、β0/β0基因型分別有208、324、6、16、8例，其中主要有IVS-2-654/N、CD17/N、CD41-42/N，占比分別為30.96%、16.90%、32.92%，見表2。

2.4 α復(fù)合β地貧基因類型及比例 45例α復(fù)合β地貧患兒中，輕型α復(fù)合β地貧33例，中間型α復(fù)合β地貧4例，重型α復(fù)合β地貧8例，其中主要有CD41-42/N+-α3.7/αα、CD41-42/N+--SEA/αα、IVS-2-654/N+-α3.7/αα，分別占比17.78%、13.33%、13.33%，見表3。

3 討論

地貧是臨床常見的常染色體單基因遺傳病，主要由調(diào)控蛋白合成的基因缺失或突變導(dǎo)致的珠蛋白合成數(shù)量不平衡，臨床上常見的有α地貧、β地貧[6]。地貧在臨床上尚無(wú)有效的根治手段，臨床上應(yīng)用鐵螯合劑及長(zhǎng)期輸血治療是其主要方法，但給家庭、個(gè)人、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)，因此加強(qiáng)地貧的遺傳咨詢及基因調(diào)查是臨床研究重點(diǎn)[7-8]。

本研究2 000例貧血患兒中，地貧檢出率為64.80%，提示在廣東陽(yáng)江地區(qū)地貧檢出率較高，臨床應(yīng)加強(qiáng)地貧的知識(shí)宣教，并通過(guò)有效的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、產(chǎn)前篩查控制疾病的發(fā)生率[9]。α地貧是α珠蛋白基因缺失，導(dǎo)致α肽鏈合成障礙，臨床根據(jù)基因缺失的不同程度分為靜止型、輕型、中間型及重型，嚴(yán)重者可能表現(xiàn)為出生后不久死亡、早產(chǎn)、死產(chǎn)，存活患兒可能出現(xiàn)心包、胸腔、腹腔積液、心臟擴(kuò)大、肝脾腫大、黃疸、嚴(yán)重貧血等[10-11]。標(biāo)準(zhǔn)型α地貧患兒無(wú)明顯臨床癥狀，極易被誤診為低色素營(yíng)養(yǎng)性貧血[12]。本研究中689例α地貧患者中靜止型α地貧68例，輕型α地貧602例，中間型α地貧19例，主要基因型有-α3.7/αα、--SEA/αα、--SEA/-α3.7，占比分別為6.68%、78.96%、6.39%。β地貧是一種具體有遺傳性的溶血性疾病，主要是由于11號(hào)染色體上珠蛋白結(jié)構(gòu)突變引起合成障礙[13-14]，近年來(lái)隨著基因篩查技術(shù)的發(fā)展，β地貧基因突變型已超過(guò)200種，當(dāng)前我國(guó)β地貧基因類型為34種，有研究提出β地貧與種族、地區(qū)相關(guān)[15]，本研究中對(duì)陽(yáng)江地區(qū)貧血兒童基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2 000例患兒中，β地貧562例，其中β+/βN、β0/βN、β+/β+、β+/β0、β0/β0基因型分別有208、324、6、16、8例，其中主要的有IVS-2-654/N、CD17/N、CD41-42/N、占比分別為30.96%、16.90%、32.92%。提示臨床應(yīng)加強(qiáng)地貧的知識(shí)宣教[16]，并加強(qiáng)遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、產(chǎn)前篩查，是降低地貧患兒的重要手段，另外對(duì)于地貧患者應(yīng)及時(shí)給予鐵劑維持生命，另外加強(qiáng)診斷及預(yù)防是當(dāng)前主要控制方法[17-18]。該研究還發(fā)現(xiàn)45例α復(fù)合β地貧患者中輕型α復(fù)合β地貧33例、中間型α復(fù)合β地貧4例、重型α復(fù)合β地貧8例，其中主要的有CD41-42/N+-α3.7/αα、CD41-42/N+--SEA/αα、IVS-2-654/N+-α3.7/αα，分別占比17.78%、13.33%、13.33%，提示對(duì)貧血患兒進(jìn)行α、β地貧檢測(cè)具有重要意義，可有效避免α復(fù)合β地貧的漏檢，降低地貧患兒的發(fā)生率[19-20]。

綜上所述，陽(yáng)江地區(qū)兒童地中海貧血發(fā)生率較高，α地貧中-α3.7/αα、--SEA/αα、--SEA/-α3.7等基因型較為常見，β地貧中IVS-2-654/N、CD17/N、CD41-42/N等基因型較為常見，α復(fù)合β地貧較少，加強(qiáng)基因型調(diào)查、婚前檢查、產(chǎn)檢、篩查等在地貧患者的診斷、治療、預(yù)防中具有重要臨床意義。

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（收稿日期：2019-08-14） （本文編輯：程旭然）