C11orf65、SLC47A1基因多態(tài)性與二甲雙胍臨床療效的相關性分析

閔翼 許雄偉

【摘要】 目的：分析中國東南地區(qū)漢族2型糖尿病患者中，C11orf65、SLC47A1基因多態(tài)性與二甲雙胍臨床療效的相關性。方法：對入組的110例初診為2型糖尿?。═2DM）患者進行為期90 d的二甲雙胍單藥治療，二甲雙胍劑量根據患者血糖控制情況進行調整，初始劑量為500 mg/d，極量2 550 mg/d，每隔15天調整1次，完成全程治療的有97例。采用熒光原位雜交法（FISH）對入組患者的血樣進行C11orf65、SLC47A1基因型檢測。觀察二甲雙胍給藥前后患者的糖尿病各項療效指標（FPG、HbA1c、HOMA-IR）的變化情況，比較C11orf65和SLC47A1不同基因型患者之間上述療效指標變化情況是否存在差異。結果：二甲雙胍單藥治療90 d后，SLC47A1各基因型之間FPG、HbA1c、HOMA-IR的變化無明顯差異（P>0.05）;C11orf65 CC基因型患者的FPG降低值明顯高于AA基因型患者（P<0.001），CC基因型患者的FPG降低值明顯高于AC基因型患者（P=0.002）;CC基因型患者的HbA1c降低值明顯高于AC、AA基因型患者（P<0.05）;CC基因型患者的HOMA-IR降低值明顯高于AA、AC基因型患者（P=0.002，P=0.004）。結論：SLC47A1基因多態(tài)性對FPG、HbA1c、HOMA-IR的影響無明顯差異，C11orf65 攜帶C等位基因比未攜帶者對空腹血糖的作用更好，CC基因型比AC基因型對HbA1c的作用更好，C11orf65攜帶C等位基因比未攜帶者的HOMA-IR降低得更多。

【關鍵詞】 C11orf65 SLC47A1 二甲雙胍 2型糖尿病 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

[Abstract] Objective： To analyze the correlation between the gene polymorphism of C11orf65 and SLC47A1 and the clinical efficacy of Metformin in patients with type 2 diabetes mellitus of Han nationality in southeast China.Method： The 110 newly diagnosed patients with type 2 diabetes were treated with Metformin monotherapy for 90 days. The dose of Metformin was adjusted according to the patients blood glucose control. The initial dose was 500 mg/d and the maximum dose was 2 500 mg/d. A total of 97 patients completed the whole course of treatment. Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to sequence the polymorphisms of SLC47A1 and C11orf65 gene loci in the enrolled patients.The changes of various indicators of diabetes before and after Metformin administration between different genotypes of C11orf65 and SLC47A1 were compared. Result： There was no significant difference in FPG， HbA1c， HOMA-IR between SLC47A1 genotypes （P>0.05）.After 90 days of Metformin treatment， FPG decreased significantly in patients with CC genotype C11orf65 compared with patients with AA genotype （P<0.001）， and FPG decreased significantly in patients with CC genotype compared with patients with AC genotype （P=0.002）.The decrease of HbA1c in CC genotype patients was significantly higher than that in AC and AA genotype patients （P<0.05）. The decrease value of HOMA-IR in patients with CC genotype was significantly higher than that in patients with AA and AC genotype （P=0.002， P=0.004）. Conclusion： The effect of SLC47A1 gene polymorphism on FPG， HbA1c， HOMA-IR after 90 days of Metformin treatment is not different. C11orf65 with C allele has a better effect on fasting blood glucose than that without C allele. The effect of CC genotype on HbA1c is better than that of AC genotype.C11orf65 with C allele has a better effect on the reduction of HOMA-IR than that without carrier.

[Key words] C11orf65 SLC47A1 Metformin Type 2 diabetes Single nucleotide polymorphism（SNP）

First-authors address： Nanping First Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Nanping 353000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.31.016

臨床上二甲雙胍的療效存在明顯的個體差異，這種差異與多種因素有關，其中遺傳因素是決定性因素[1]，但其機制尚不清楚，可能與藥物代謝酶、藥物轉運體、藥物作用靶點等相關基因的多態(tài)性有關。SLC47A1（rs2289669G>A）基因位于第17號染色體短臂1區(qū)1帶第2亞帶，主要編碼多藥及毒素外排蛋白1（MATE1）[2-3]。MATE1在介導有機陽離子（包括藥物、毒物和內源性代謝產物）的轉運過程中發(fā)揮重要作用，包括將底物泵出細胞，轉運至膽管或隨尿液排出，從而降低底物在肝臟和腎臟細胞內的濃度[4-5]。二甲雙胍就是其代表性底物。研究發(fā)現SLC47A1基因多態(tài)性會影響MATE1轉運功能[6]，會影響底物的藥動學和藥效學，同時它可能與2型糖尿病患者經二甲雙胍治療后糖化血紅蛋白（HbAlc）的降低有關[7-9]。韋娜等[10]2018年進行meta分析，共納入6個研究，共880例研究對象，最后的結論認為2型糖尿病患者SLC47A1基因多態(tài)性對二甲雙胍的療效有顯著影響，SLC47A1基因多態(tài)性檢測可以作為二甲雙胍療效的預測手段。但是，也有研究報道SLC47A1多態(tài)性對二甲雙胍療效并無影響[11]。因此SLC47A1多態(tài)性是否對二甲雙胍療效和不良反應產生影響尚存在爭議，本研究擬通過實驗進行進一步確認。C11orf65（rs11212617 C>A）基因位于11號染色體第65個開放閱讀框，一般認為它是影響二甲雙胍降血糖反應的關鍵基因。二甲雙胍主要通過抑制線粒體呼吸鏈復合體，活化AMP蛋白激酶（AMPK），增加細胞內AMP來改善空腹血糖水平。AMPK通路的激活被認為是二甲雙胍抑制肝糖異生的重要基礎機制。Zhou等[12]認為C11orf65基因參與DNA修復和細胞周期調控，在AMP活化蛋白激酶上游發(fā)揮調控二甲雙胍的作用，該基因的變異改變了二甲雙胍的降血糖反應。Leeuwen等[13]通過meta分析，探討C11orf65不同基因型是否影響二甲雙胍治療后糖化血紅蛋白下降和達標的能力，發(fā)現C11orf65基因多態(tài)性與糖化血紅蛋白下降的關系不顯著。Florez等[14]研究發(fā)現C11orf65 基因多態(tài)性與前期患者的糖尿病發(fā)病率并無關系，而與二甲雙胍治療效果有關。這兩項研究的樣本均來自英國，目前對中國漢族人群研究較少。而且，關于C11orf65基因多態(tài)性是否影響二甲雙胍療效存在矛盾報道，尚待進一步明確，以便更好指導臨床個體化治療。

總之，目前在2型糖尿?。═2DM）患者中，關于SLC47A1、C11orf65的基因多態(tài)性與二甲雙胍臨床療效之間的相關性研究不多，研究結果也不一致，故本研究擬通過分子遺傳學的方法分析SLC47A1、C11orf65基因多態(tài)性與二甲雙胍療效的相關性，以期找到明確預測有效性的遺傳標記，從而指導臨床個體化治療，最終達到提高血糖達標率，減少醫(yī)療費用的目的，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 生理鹽水（湖北興華制藥有限公司）;滅菌等離子水（實驗室自制）;DNA提取液10%NH4CL（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）;DNA保存液（耀金保：北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）;測序反應通用試劑盒（耀金分：北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）;葡萄糖測定試劑盒（安徽大千生物工程有限公司）;胰島素測定試劑盒（美國西門子）;糖化血紅蛋白A1c檢測試劑盒（Bio-Rad Laboratories，Inc.）。

1.2 主要儀器 渦旋混勻儀（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，XH-D）;高速離心機 （安徽中科中佳科學儀器有限公司，HC-2516）;掌上離心機（其林貝爾儀器制造有限公司，LX-400）;實時熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司，RT-CyclerTM436/TL998A）;離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司，KDC-1042）;全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（美國西門子，ADVIA Centaur XP）;全自動血紅蛋白測試系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Inc.，ARIANT II）;全自動血液分析儀（sysmex株式會，XN 9000）。

1.3 方法

1.3.1 臨床試驗對象 試驗對象為2018年1月-2019年2月初診于本院的110例2型糖尿?。═2DM）患者，男50例，女47例;年齡20～75歲，平均（58.2±14.0）歲。所有受試者均為中國東南地區(qū)漢族人，個體間無親緣關系，所有受試者均簽署知情同意書。

1.3.2 入組標準 （1）符合1999年WHO糖尿病診斷標準的初診2型糖尿病患者，即糖尿病癥狀（多飲、多尿、多食、體質量下降），加上隨機血糖檢測≥11.1 mmol;FPG（空腹血糖）≥7.0 mmol/L;或者加上糖負荷后2 h血糖檢測≥11.1 mmol。任意滿足其中一個條件并且重復證實，診斷成立。（2）年齡大于16周歲。（3）空腹血糖介于7.0～18.0 mmol/L。（4）身高體重指數（BMI）18.5～27.5 kg/m2。（5）最近15 d無口服降糖藥物或者胰島素治療史。

1.3.3 排除標準 （1）腎功能不全[血肌酐水平男性>132.6 μmol/L（1.5 mg/dL），女性>123.8 μmol/L（1.4 mg/dL）或預估腎小球濾過率（GFR）<45 mL/min]、肝功能不全、嚴重感染、缺氧或接受大手術的患者、糖尿病高滲性昏迷、酮癥酸中毒、嚴重心血管疾病;（2）急性或慢性心功能不全者;血液疾病;（3）懷孕和哺乳期婦女;（4）嗜酒者。

1.3.4 中止實驗標準 （1）患者服藥過程中如出現血乳酸增高>3 mmol/L，尿酮體、血肌酐>120 mmol/L，尿酮陽性應立即停藥，根據醫(yī)生判斷應該停止臨床試驗者。（2）患者出現心絞痛，心肌梗死，間歇性跛行，以及敗血癥，心、肺和肝、腎功能惡化時均應停藥。（3）患者依從性差，漏服藥物累計10 d或者10 d以上。（4）受試者在臨床實驗過程中由于個人原因主動向醫(yī)生提出中止。（5）其他原因。

1.3.5 給藥方案 服用鹽酸二甲雙胍片（格華止，生產廠家：中美上海施貴寶制藥有限公司，批準文號：H20023370，規(guī)格：0.5 g*20 s），研究觀察療程為90 d。監(jiān)測治療前后空腹血糖、空腹胰島素，糖化血紅蛋白，避免飲酒。每隔15天調整一次藥物劑量：若患者FPG≥7 mmol/L，500 mg/d或750 mg/d則劑量加倍，1 000 mg/d則加至1 500 mg/d，最大劑量為2 500 mg/d;若FPG<7.0 mmol/L，繼續(xù)維持該劑量直至隨訪結束。如果服藥期間發(fā)生了與二甲雙胍有關的胃腸道等不良反應并且在服藥4～10 d后仍未改善，可酌情將其劑量下調或停藥。

1.3.6 SLC47A1、C11orf65基因多態(tài)性檢測 采用2 mL EDTA抗凝管進行受試者靜脈血的收集。 SLC47A1、C11orf65基因型檢測采用國家衛(wèi)生健康委員會《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）》中推薦的9種測序方法之一的熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）法。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)分布采用（x±s）表示，比較采用配對t檢驗;計量資料符合偏態(tài)分布采用中位數四分位數間距進行描述，組間比較采用Kruskal-Wallis H驗比較偏態(tài)分布計量資料的組間差異，組內比較采用Wilcoxon檢驗。計數資料采用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗。采用多重線性回歸調整年齡、性別、BMI和藥物劑量，并采用方差分析比較初始的和用線性回歸預測的ΔFPG、ΔHbA1c、ΔHOMA-IR差異，采用LSD法兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本研究共有110例患者入選完成了基線特征調查，8例因不良反應退出研究，5例依從性差，累積漏服藥物10 d以上，97例患者完成3個月的最終隨訪。97例研究對象均為東南地區(qū)漢族人群，平均年齡（58.2±14.0）歲，男50例（51.5%），女47例（48.5%），BMI（24.4±3.3）kg/m2。

2.1 基因位點的基因分型和等位基因頻率 中國漢族T2DM患者人群中SLC47A1與C11orf65位點的等位基因頻率分布服從Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示所選人群具有較好的群體代表性。見表1。

2.2 SLC47A1、C11orf65不同基因型基本特征比較 治療前不同基因型組之間，患者性別、年齡、BMI指數比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。對SLC47A1和C11orf65不同基因型組的受試者進行人口社學會學特征的比較，不同基因組之間的性別、年齡、BMI指數比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2、3。

2.3 SLC47A1、C11orf65 不同基因型間二甲雙胍臨床療效的比較

2.3.1 SLC47A1不同基因型與二甲雙胍臨床療效的關聯 調整性別、年齡、BMI和用藥劑量后，ΔFPG、ΔHbA1c、ΔHOMA-IR之間的差異比較均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

2.3.2 C11orf65不同基因型與二甲雙胍臨床療效的關聯 調整性別、年齡、BMI和用藥劑量后，發(fā)現AA基因型比CC基因型的ΔFPG低（P<0.001），AC基因型比CC基因型的ΔFPG低（P=0.002），AC基因型比CC基因型的ΔHbA1c低（P=0.048），AA基因型比CC基因型的ΔHOMA-IR低（P=0.002），AC基因型比CC基因型的ΔHOMA-IR低（P=0.004）。其他基因型ΔFPG、ΔHbA1c、ΔHOMA-IR之間的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

3 討論

本研究顯示，SLC47A1基因多態(tài)性對FPG、HbA1c、HOMA-IR的影響無明顯差異，C11orf65 攜帶C等位基因比未攜帶者對空腹血糖的作用更好，CC基因型比AC基因型對HbA1c的作用更好，C11orf65攜帶C等位基因比未攜帶者的HOMA-IR降低得更多。

97例T2DM患者中，C11orf65基因型分布頻數：CC（47.4%）、AC（38.2%）、AA（14.4%）;SLC47A1基因型分布頻數：AA（22.7%）、GA（55.7%）、GG（21.6%）。本次實驗得到的中國東南地區(qū)漢族T2DM患者SLC47A1、C11orf65等位基因頻率分布與2014年陳培賢[2]公布的中國漢族人群的基因頻率不一致。他們公布的C11orf65基因型分布頻數：CC（30.5%）、AC（52.4%）、AA（17.1%）;SLC47A1基因型分布頻數： AA（6.1%）、GA（79.3%）、GG（14.6%）?；蝾l率分布不同的可能原因是地區(qū)差異，但目前的研究相對較少，且樣本量較小，還需要進一步擴大樣本量。

SLC47A1編碼的多藥毒素擠壓轉運蛋白1 （MATE1）定位于腎小管細胞刷狀緣膜，與OCT2共同介導二甲雙胍從血到尿的清除[15]。SLC47A1基因的某些變異可能影響二甲雙胍的分布和清除。文獻[9]報道，與G等位基因攜帶者相比，SLC47A1 A等位基因純合子攜帶者在接受二甲雙胍治療6個月后，糖化血紅蛋白含量顯著降低。也就是說，20%的2型糖尿病患者糖化血紅蛋白的降低比其余患者高0.55%（即降低2倍）。有研究認為，SLC47A1基因多態(tài)性與二甲雙胍單藥治療90 d以后的糖化血紅蛋白水平變化情況無影響[2]。本次研究中通過二甲雙胍單藥治療90 d后，觀察T2DM患者治療前、治療后的各血糖指標變化情況，對數據進行整理分析后發(fā)現攜帶A等位基因比未攜帶A等位基因的基因型C肽增加更多（P=0.010），提示胰島β細胞分泌胰島素的功能恢復得更好。FPG、HbA1c、HOMA-IR的變化差異在各個基因型之間無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與Tká?等[9]研究的結論不一致，與陳培賢[2]研究結論部分一致，SLC47A1基因多態(tài)性對FPG、糖化血紅蛋白的影響一致，均認為SLC47A1對上述T2DM的血糖指標影響不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;但對胰島素抵抗指數的影響，觀點不一致，前者認為SLC47A1基因多態(tài)性與二甲雙胍單一藥物治療后HOMA-IR變化有關，SLC47A1 AG基因型比GG/AA基因型胰島素抵抗指數增加幅度更多[2]。本實驗研究發(fā)現治療前后的HOMA-IR變化與SLC47A1 基因多態(tài)性無關。

有研究指出中國人群中C11orf65基因多態(tài)性與二甲雙胍的療效有關，帶有A等位基因的患者療效優(yōu)于不帶有A等位基因患者[16]。另一項研究認為C11orf65基因多態(tài)性與二甲雙胍治療后FPG水平變化有關聯，AC基因型對二甲雙胍降糖更有效，同時還提示該位點與二甲雙胍治療后β細胞功能指數水平變化有關，AC基因型對二甲雙胍治療后β細胞功能指數影響更大[2]。本研究通過調整性別、年齡、BMI和用藥劑量等變量后，發(fā)現C11orf65 CC基因型比AA基因型降低FBG值更多（P<0.001），CC基因型比AC基因型降低FBG值更多（P=0.002），即攜帶A等位基因的基因型比不攜帶A等位基因的降低空腹血糖效果差;發(fā)現CC基因型比AC基因型降低HbA1c更多（P=0.048）;CC基因型降低HOMA-IR比AA基因型多（P=0.002），CC基因型降低HOMA-IR比AC基因型更多（P=0.004）。結果與上述研究結論部分一致，可能與種族、人群、樣本量等有關，有的研究樣本偏小，可能影響實驗結果。同是中國漢族人群，地區(qū)差異可能會導致等位基因頻率的差異，也會影響到最終結果。研究發(fā)現，針對中國人群的研究，樣本量都較小，且研究不多，因而研究結果還需要通過擴大樣本量或采取多中心研究進一步驗證。

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（收稿日期：2019-09-24） （本文編輯：周亞杰）