畜禽球蟲(chóng)生物學(xué)與球蟲(chóng)病防治研究
——記上海獸醫(yī)研究所四十年研究回顧

黃 兵，韓紅玉，董 輝，趙其平，朱順海

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

0 前言

球蟲(chóng)（Coccidia）隸屬于頂復(fù)器門（Apicomplexa Levine，1970）、孢子蟲(chóng)綱（Sporozoasida Leuckart，1879）、真球蟲(chóng)目（Eucoccidiorida Léger and Duboscq，1910）的原蟲(chóng)，廣義的球蟲(chóng)范圍包括真球蟲(chóng)目中隱球蟲(chóng)亞目（Adeleorina L é ger，1911）和艾美耳球蟲(chóng)亞目（Eimeriorina L é ger，1911）所含的種類近2000種，其中艾美耳球蟲(chóng)亞目的種類約1500種，隸屬于10科37屬；狹義的球蟲(chóng)范圍主要指艾美耳球蟲(chóng)亞目中艾美耳科（Eimeriidae Minchin，1903）所含的種類，約有1300多種，隸屬于16屬，其中艾美耳屬（EimeriaSchneider，1875）的球蟲(chóng)超過(guò)1000種[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界已在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物發(fā)現(xiàn)艾美耳科球蟲(chóng)2599種，其中在哺乳類1028種、鳥(niǎo)類734種、爬行類456種、兩棲類53種、魚(yú)類314種、無(wú)脊椎類14種[2]。球蟲(chóng)病是危害動(dòng)物健康的一類重要原蟲(chóng)病，特別對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害巨大，每年可導(dǎo)致上億元的經(jīng)濟(jì)損失。幾十年來(lái)我國(guó)在球蟲(chóng)與球蟲(chóng)病防治研究方面做了大量工作，僅從中國(guó)知網(wǎng)以“球蟲(chóng)”作為主題檢出的各類文獻(xiàn)達(dá)13 000多條。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所（原：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海家畜血吸蟲(chóng)病研究所）是我國(guó)從事球蟲(chóng)與球蟲(chóng)病防治研究的主要單位之一，開(kāi)發(fā)的國(guó)家二類新獸藥——地克珠利曾獲得國(guó)家科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)，研制的抗球蟲(chóng)病DLV三價(jià)疫苗是國(guó)內(nèi)首個(gè)獲得國(guó)家新獸藥證書(shū)的球蟲(chóng)疫苗，起草制訂了第1個(gè)球蟲(chóng)病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，在國(guó)內(nèi)外發(fā)表球蟲(chóng)相關(guān)研究報(bào)告300多篇?；仡欉^(guò)去近40年的工作，主要在以下幾個(gè)方面取得重要進(jìn)展。

1 流行病學(xué)

球蟲(chóng)在我國(guó)畜禽中分布十分廣泛，種類較多。史天衛(wèi)等[3]（1989）對(duì)上海地區(qū)雞球蟲(chóng)種類進(jìn)行了初步調(diào)查，記錄了雞的6種艾美耳球蟲(chóng)。據(jù)文獻(xiàn)記載[4-6]，在我國(guó)的馬、駱駝、牛、羊、豬、犬、貓、兔、雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉等已檢出球蟲(chóng)145種（表1），其中艾美耳球蟲(chóng)122種，等孢球蟲(chóng)（IsosporaSchneider, 1881）13種，泰澤球蟲(chóng)（TyzzeriaAllen，1936）6種，溫?fù)P球蟲(chóng)（WenyonellaHoare，1933）4種；球蟲(chóng)分布達(dá)到15個(gè)及以上省市自治區(qū)的有41種，包括雞球蟲(chóng)9種、牛球蟲(chóng)5種、兔球蟲(chóng)11種、羊球蟲(chóng)9種、豬球蟲(chóng)5種、鴨球蟲(chóng)2種（表2）；還鑒定命名了11個(gè)新種，包括艾美耳球蟲(chóng)10種和等孢球蟲(chóng)1種（表3）。經(jīng)調(diào)查，1）上海雞場(chǎng)的球蟲(chóng)感染率通常在45%以上，1/3雞場(chǎng)感染率達(dá)90%～100%；球蟲(chóng)陽(yáng)性雞的感染強(qiáng)度（每克糞便卵囊數(shù)，OPG）為400～63 800個(gè)，平均OPG為32 114個(gè)，超過(guò)50%雞場(chǎng)的OPG在48 000個(gè)以上；鑒定出6種球蟲(chóng)，即柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E. tenella）、毒害艾美耳球蟲(chóng)（E. necatrix）、巨型艾美耳球蟲(chóng)（E. maxima）、堆型艾美耳球蟲(chóng)（E. acervulina）、變位艾美耳球蟲(chóng)（E. mivati）以及緩艾美耳球蟲(chóng)（E. mitis）[7]。2）上海鴨場(chǎng)的球蟲(chóng)感染率為61%，3月齡以內(nèi)鴨的感染率為100%；球蟲(chóng)陽(yáng)性鴨的OPG為300～112 200，平均OPG為4 841；鑒定出10種球蟲(chóng)，其中艾美耳屬6種、溫?fù)P屬3種、等孢屬1種[8,9]。3）上海部分鴿場(chǎng)的球蟲(chóng)感染率為52.8%，球蟲(chóng)陽(yáng)性鴿的OPG為300～512 400，平均OPG為50 159個(gè)，肉鴿的感染率（55.2%）和平均OPG（52 110個(gè)）均高于信鴿（40.9%和37 583個(gè)）；鑒定出5種球蟲(chóng)，即拉氏艾美耳球蟲(chóng)（E. labbeana）、鴿艾美耳球蟲(chóng)（E.columbae）、原鴿艾美耳球蟲(chóng)（E. columbarum）、杜氏艾美耳球蟲(chóng)（E. duculai）和卡氏艾美耳球蟲(chóng)（E. kapotei），拉氏艾美耳球蟲(chóng)為肉鴿的優(yōu)勢(shì)種，原鴿艾美耳球蟲(chóng)為信鴿的優(yōu)勢(shì)種[5]。4）上海17個(gè)奶牛場(chǎng)（2005年-2006年）的球蟲(chóng)感染率為40.82%（10%～63.64%），平均OPG為1919個(gè)（100～43 500個(gè)），鑒定出6種球蟲(chóng)，分別是牛艾美耳球蟲(chóng)（E.bovis）、橢圓艾美耳球蟲(chóng)（E. ellipsoidallis）、邱氏艾美耳球蟲(chóng)（E. zürnii）、懷俄艾美耳球蟲(chóng)（E.wyomingensis)、柱狀艾美耳球蟲(chóng)（E. cylindrica）和亞球形艾美耳球蟲(chóng)（E. subspherica）[10]。上海24個(gè)奶牛場(chǎng)（2010年～2011年）的球蟲(chóng)感染率為47.12%，平均OPG為3181個(gè)，感染率和OPG均隨牛月齡的增長(zhǎng)而下降，鑒定出10種球蟲(chóng)，除前面提及的6種外，另檢出阿拉巴馬艾美耳球蟲(chóng)（E. alabamensis）、奧博艾美耳球蟲(chóng)（E. auburnensis）、巴西利亞艾美耳球蟲(chóng)（E. brasiliensis）和皮利他艾美耳球蟲(chóng)（E. pellita）[11]。全國(guó)6個(gè)省市自治區(qū)（2010年）27個(gè)奶牛場(chǎng)435份糞樣，除北京1個(gè)場(chǎng)9份糞樣未檢出球蟲(chóng)外，其余5個(gè)省市自治區(qū)的26個(gè)奶牛場(chǎng)全部檢出球蟲(chóng)，426份糞樣的球蟲(chóng)檢出率為50.94%，平均OPG為3158個(gè)[12]。5）青海省4縣324份牦牛糞樣（2010年11月～2011年1月），球蟲(chóng)陽(yáng)性率為34.9%，平均OPG為251，1歲內(nèi)犢牛的感染率和OPG均顯著高于1歲以上青年牛和成年牛，鑒定出14種球蟲(chóng)，除前面提及的10種外，還檢出加拿大艾美耳球蟲(chóng)（E. canadensis）、伊利諾斯艾美耳球蟲(chóng)（E.illinoisensis）、孟買艾美耳球蟲(chóng)（E. bombayansis）和布基隆艾美耳球蟲(chóng)（E. bukidnonensis）[13]。

表1 我國(guó)檢出的畜禽球蟲(chóng)種類Table 1 The Coccidian species of livestock and poultry in China

（續(xù)上表）

表2 分布達(dá)15個(gè)省市自治區(qū)的41種球蟲(chóng)Table 2 41 species of Coccidia distributed in 15 or more provinces, municipalities and autonomous regions

表3 國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的11個(gè)球蟲(chóng)新種Table 3 11 new species of Coccidia identi fied in China

（續(xù)上表）

2 蟲(chóng)種分離

球蟲(chóng)的純種分離是進(jìn)行球蟲(chóng)形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、體外培養(yǎng)、免疫學(xué)以及藥物篩選等研究的基礎(chǔ)與前提條件，進(jìn)行球蟲(chóng)純種分離的常用方法是單卵囊分離。我們采用該方法，先后分離獲得了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)[14]、毒害艾美耳球蟲(chóng)[15]、堆型艾美耳球蟲(chóng)[16]、變位艾美耳球蟲(chóng)[17]、巨型艾美耳球蟲(chóng)[18]等5種球蟲(chóng)的純種，對(duì)該5種球蟲(chóng)和布氏艾美耳球蟲(chóng)[19]的基本生物學(xué)特征和致病性進(jìn)行了測(cè)定。觀察了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)配子體生殖階段的超微結(jié)構(gòu)[20]，檢測(cè)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、毒害艾美耳球蟲(chóng)、變位艾美耳球蟲(chóng)的卵囊排泄期[21]和該3種球蟲(chóng)的交叉免疫保護(hù)效果[22]，規(guī)范了雞球蟲(chóng)的分離、培養(yǎng)、鑒定、保存方法[23]。隨后，又對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的6種11株雞球蟲(chóng)進(jìn)行了單卵囊純化，經(jīng)對(duì)單卵囊分離物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)保存的布氏艾美耳球蟲(chóng)被柔嫩艾美耳球蟲(chóng)污染[24]。對(duì)實(shí)驗(yàn)室確定為純種的5種12株雞球蟲(chóng)，進(jìn)行了線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基（mtCOI）基因片段序列的克隆和同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示球蟲(chóng)同種不同株間的同源性為100%，異種間為86.1%～98.4%，說(shuō)明mtCOI基因可成為區(qū)分雞球蟲(chóng)不同種的理想靶基因[25]。王鑫等[26]（2009）、蔡蘭等[27]（2011）分別用18S rDNA基因?qū)?shí)驗(yàn)室保存的3種8株、4種15株雞艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果球蟲(chóng)不同種間的同源性為96.5%～98.1%和94.6%～99.4%，巨型艾美耳球蟲(chóng)不同株間的同源性為98.7%～99.3%和96.9%～99.8%，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同株間的同源性為99.7%～99.9%和99.0%～99.9%，說(shuō)明18S rDNA基因不僅可以區(qū)分不同種，還有可能成為區(qū)分同種不同株的理想靶基因。這些研究結(jié)果為雞球蟲(chóng)的分子遺傳學(xué)鑒定提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 診斷技術(shù)

球蟲(chóng)病的診斷以病原學(xué)檢查為主，在臨床上常結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢。為使球蟲(chóng)病的診斷更加規(guī)范和便于操作，在全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)的指導(dǎo)下，我們起草了“動(dòng)物球蟲(chóng)病診斷技術(shù)”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局于2002年2月正式發(fā)布（GB/T 18647-2002）[28]。該標(biāo)準(zhǔn)適用于禽類和兔的球蟲(chóng)病（感染）的診斷，包括病原檢查和病理檢查兩部分，詳細(xì)敘述了每項(xiàng)檢查的操作步驟和判定依據(jù)，已在動(dòng)物進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫和現(xiàn)場(chǎng)球蟲(chóng)病的診斷中廣泛使用。隨著人們對(duì)大家畜（特別是奶牛）球蟲(chóng)病的重視，我們?cè)谶M(jìn)行奶牛球蟲(chóng)感染情況調(diào)查的基礎(chǔ)上，對(duì)奶牛球蟲(chóng)卵囊的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究[29]，考察了6種卵囊漂浮液分別對(duì)4種奶牛糞便量的球蟲(chóng)檢測(cè)效果，確定飽和鹽水為奶牛球蟲(chóng)卵囊檢測(cè)漂浮液，10 g為合適的糞便取樣量，為建立奶牛球蟲(chóng)病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。在逐步規(guī)范奶牛球蟲(chóng)病病原檢測(cè)方法的同時(shí)，也開(kāi)展了奶牛球蟲(chóng)感染PCR診斷方法的研究[30]，用提取的奶牛球蟲(chóng)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后條帶單一而清晰，孢子化卵囊和未孢子化卵囊均能擴(kuò)增出大小相同的片斷，經(jīng)特異性檢測(cè)，作為對(duì)照樣品的安氏隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium andersoni）、剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella）基因組DNA均無(wú)相同的擴(kuò)增條帶，實(shí)驗(yàn)顯示其最少卵囊檢出量為5000 個(gè)/mL，臨床樣品檢測(cè)顯示最少檢出量的OPG為2780 個(gè)，該方法還有待進(jìn)一步完善。

4 藥物防治

自1939年發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物具有抗球蟲(chóng)效果以來(lái)，國(guó)內(nèi)外使用過(guò)的抗球蟲(chóng)藥物品種已超過(guò)30種，包括3大類，屬于離子載體類抗球蟲(chóng)藥有莫能菌素（Monensin）、拉沙里菌素（Lasalocid）、鹽霉素（Salinomycin）、那拉霉素（Narasin）、馬杜霉素（Maduramicin）、賽杜霉素（Semduramycin）和海南霉素（Hainanmycin）等及相關(guān)制劑，屬于化學(xué)合成類抗球蟲(chóng)藥主要有磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline）、尼卡巴嗪（Nicarbazin）、呋喃唑酮（Furazolidone）、球痢靈（Zoalene）、氨丙啉（Amprolium）、磺胺氯吡嗪（Sulfachlorpyrazine）、氯羥吡啶（Clopidol）、磺胺間二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine）、癸氧喹酯（Decoquinate）、氯苯胍（Robenidine）、氟腺呤（Arprinocid）、常山酮（Halofuginone）、妥曲珠利（Toltrazuril）和地克珠利（Diclazuril）等及相關(guān)制劑，屬于中草藥類抗球蟲(chóng)藥主要有青蒿、驅(qū)球凈、五草湯、敵球靈和白頭翁散等。這些抗球蟲(chóng)藥的使用，為有效控制畜禽球蟲(chóng)病、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。

上海獸醫(yī)研究所從事球蟲(chóng)病藥物防治研究近40年，建立了一套完善的抗球蟲(chóng)藥物臨床試驗(yàn)方法，先后完成了氯苯胍、蒽環(huán)類抗生素80334、尼卡巴嗪、馬杜霉素、海南霉素、地克珠利等藥物的抗雞球蟲(chóng)病臨床試驗(yàn)。率先開(kāi)展了國(guó)產(chǎn)氯苯胍防治雞球蟲(chóng)病研究，進(jìn)行了氯苯胍對(duì)雞球蟲(chóng)病的籠飼試驗(yàn)與田間試驗(yàn)、對(duì)雞的安全試驗(yàn)、新舊工藝產(chǎn)品的療效對(duì)比試驗(yàn)等，該項(xiàng)研究獲得1980年上海市農(nóng)業(yè)科技成果二等獎(jiǎng)[31,32]。與上海醫(yī)藥工業(yè)研究院合作，開(kāi)展了蒽環(huán)類抗生素80334防治雞球蟲(chóng)病研究，進(jìn)行了防治柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病籠飼試驗(yàn)[33]、雞球蟲(chóng)混合感染試驗(yàn)[34]、不同地理株防治試驗(yàn)[35]、野外試驗(yàn)[36]、對(duì)雞的安全試驗(yàn)[37]、在雞體內(nèi)殘留動(dòng)態(tài)[38]、對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)作用后裂殖體超微結(jié)構(gòu)觀察[39]等，該項(xiàng)研究獲得1984年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院技術(shù)改進(jìn)三等獎(jiǎng)[40]。與上海醫(yī)藥工業(yè)研究院合作，開(kāi)展了尼卡巴嗪防治雞球蟲(chóng)病研究，進(jìn)行了籠飼試驗(yàn)[41]、雞體內(nèi)殘留量測(cè)定[42]、田間試驗(yàn)與安全試驗(yàn)[43]、對(duì)雞球蟲(chóng)免疫力產(chǎn)生影響的觀察[44]等，該項(xiàng)研究獲得1990年國(guó)家醫(yī)藥管理局科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)[45]。與美國(guó)氰胺公司合作，承擔(dān)了馬杜霉素進(jìn)口注冊(cè)的抗雞球蟲(chóng)病臨床驗(yàn)證工作，分別完成了籠飼試驗(yàn)[46]和田間試驗(yàn)[47]。自主研制開(kāi)發(fā)了抗球蟲(chóng)病新藥地克珠利，用原料藥或預(yù)混劑進(jìn)行了防治雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)試驗(yàn)[48]、不同劑量的藥效試驗(yàn)[49]、防治雞球蟲(chóng)病現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)[50]、防治雞球蟲(chóng)不同地理株試驗(yàn)[51]、防治雞球蟲(chóng)5個(gè)蟲(chóng)種的籠飼試驗(yàn)[52]等，原料藥和0.5%預(yù)混劑于1997年4月率先獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的新獸藥證書(shū)[（97）新獸藥證字第03號(hào)、04號(hào)]，該項(xiàng)研究分別獲得1998年農(nóng)業(yè)部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)和1999年國(guó)家科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)[53]。同時(shí)開(kāi)發(fā)了0.5%地克珠利溶液，考察了其預(yù)防雞球蟲(chóng)病的效果[54]，于1999年4月獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的新獸藥證書(shū)[（99）新獸藥證字第04號(hào)]，該項(xiàng)研究獲得2000年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)技術(shù)二等獎(jiǎng)[55]。與江蘇省常州市第二制藥廠合作，開(kāi)展了海南霉素防治雞球蟲(chóng)病研究，進(jìn)行了該藥對(duì)5種雞球蟲(chóng)的藥效試驗(yàn)[56]、防治雞球蟲(chóng)病舍飼試驗(yàn)[57]，雞球蟲(chóng)廣州分離株的療效試驗(yàn)[58]、雞球蟲(chóng)病的預(yù)防和治療效果評(píng)價(jià)[59]等，該產(chǎn)品為我國(guó)第一個(gè)獲得一類新獸藥證書(shū)的原創(chuàng)性抗球蟲(chóng)藥。此外，還進(jìn)行了水溶性氨丙啉防治柔嫩艾美耳球蟲(chóng)籠飼試驗(yàn)，經(jīng)連續(xù)7 d飲水給藥，其抗球蟲(chóng)指數(shù)（anticoccidiosis index，ACI）達(dá)188，試驗(yàn)組飲水量與健康對(duì)照組無(wú)顯明差異[60]；比較了地克珠利、常山酮、氯羥吡啶、馬杜霉素、鹽霉素預(yù)防柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的效果，其ACI，地克珠利、常山酮、馬杜霉素均在192以上，氯羥吡啶為168～180，鹽霉素為165～171[61]；進(jìn)行了地克珠利、拉沙里菌素、莫能菌素防治現(xiàn)場(chǎng)奶牛球蟲(chóng)病研究，連續(xù)用藥9 d后奶牛的球蟲(chóng)卵囊減少率分別為78.91%、80.92%、98.82%[62]；開(kāi)展了地克珠利、磺胺喹惡啉鈉、磺胺氯吡嗪鈉、托曲珠利、白頭翁散等5種藥物對(duì)肉鴿球蟲(chóng)病的防治試驗(yàn)，其相對(duì)卵囊減少率，2種磺胺藥均在98%以上，白頭翁散為91%～99%，托曲珠利為88%～93%，地克珠利為67.4%～79.6%[63]。近年還研制與測(cè)定了中草藥制劑TF-103[64]、化學(xué)合成藥納川珠利（Nitromezuri）[65,66]與沙咪珠利（Acetamizuril）[67]的抗球蟲(chóng)效果，有望開(kāi)發(fā)成新的抗球蟲(chóng)藥。

5 抗藥性檢測(cè)

任何一種抗球蟲(chóng)藥的長(zhǎng)期或不合理使用，都會(huì)導(dǎo)致球蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生。定期檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)球蟲(chóng)對(duì)抗球蟲(chóng)藥物的耐受程度，將有助于制訂合理的用藥方案，有效控制球蟲(chóng)病的發(fā)生，減少因球蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失。檢測(cè)球蟲(chóng)耐藥性的方法有籠飼試驗(yàn)法、雞胚試驗(yàn)法、細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、同工酶電泳測(cè)定法、PCR測(cè)定法等，其中籠飼試驗(yàn)法中又采用卵囊產(chǎn)量、病變記分、增重、最適抗球蟲(chóng)活性百分率、糞便記分比率、抗球蟲(chóng)指數(shù)等單項(xiàng)或多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定[68,69]。孔繁瑤等[70]（1994）在檢測(cè)我國(guó)12個(gè)省區(qū)15株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)5種抗球蟲(chóng)藥物的敏感性時(shí)，率先采用最適抗球蟲(chóng)活性百分率（percent of optimum anticoccidial activity，POAA）、病變記分減少率（reduction of lesion scores，RLS）、相對(duì)卵囊產(chǎn)量（relative oocyst production，ROP）3項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)所測(cè)球蟲(chóng)株對(duì)藥物的抗藥程度，分為敏感（-）、輕度抗藥（+）、中度抗藥（++）、嚴(yán)重抗藥（+++）4個(gè)等級(jí)。黃兵等[71]在對(duì)上海一雞場(chǎng)球蟲(chóng)進(jìn)行3種抗球蟲(chóng)藥物的抗藥性檢測(cè)中，在POAA、RLS、ROP的基礎(chǔ)上增加了抗球蟲(chóng)指數(shù)（ACI），采用4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行抗藥性評(píng)價(jià)，分為敏感（-）、輕度抗藥（+）、中度抗藥（++）、嚴(yán)重抗藥（+++或++++）4個(gè)等級(jí)。隨后在對(duì)上海9個(gè)區(qū)縣10個(gè)雞場(chǎng)的球蟲(chóng)進(jìn)行6種藥物的抗藥性檢測(cè)中[72]，繼續(xù)采用了POAA、RLS、ROP、ACI 4項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)判所檢測(cè)球蟲(chóng)的抗藥性，結(jié)果達(dá)到中度及以上抗藥程度的百分比為莫能霉素100%、氨丙啉90%、氯羥吡啶80%、馬杜霉素50、氯苯胍10%、地克珠利為0。陳兆國(guó)等[73]從4項(xiàng)指標(biāo)各自的特點(diǎn)、評(píng)價(jià)結(jié)果的一致性、其他指標(biāo)、試驗(yàn)總體結(jié)果等4個(gè)方面，對(duì)采用POAA、RLS、ROP、ACI進(jìn)行球蟲(chóng)抗藥性判定的準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為該綜合評(píng)定球蟲(chóng)抗藥性的方法是有效的、可靠的。我們根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)球蟲(chóng)抗藥性的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)相關(guān)雞場(chǎng)提出了合理使用抗球蟲(chóng)藥的建議方案，在試驗(yàn)基地采取了預(yù)防或減少抗藥性產(chǎn)生的措施，有效地控制了雞球蟲(chóng)病的發(fā)生，提高了養(yǎng)雞場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，該項(xiàng)目獲得2003年上海市科技進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)[74]。至今，POAA、RLS、ROP、ACI 4項(xiàng)指標(biāo)已在檢測(cè)雞球蟲(chóng)抗藥性中廣泛應(yīng)用，如檢測(cè)廣東[58,75,76]、陜西[77-79]、安徽[80-82]、江蘇[80,83,84]、甘肅[85]、青海[86]、河北[87,88]、吉林[89,90]、廣西[91]、浙江[92]等省地區(qū)相關(guān)雞場(chǎng)球蟲(chóng)對(duì)抗球蟲(chóng)藥物的抗藥性，均采用這4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行判定。

此外，還誘導(dǎo)獲得了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)地克珠利抗藥株和馬杜拉霉素抗藥株[93]，構(gòu)建了2個(gè)抗藥株與敏感株的差異表達(dá)基因消減cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)一些可能與耐藥性產(chǎn)生相關(guān)的基因（如柔嫩艾美耳球蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶基因）[94]，用銀染mRNA差異顯示技術(shù)分析了抗藥株與敏感株之間的差異表達(dá)基因[96]，并比較了抗藥株與敏感株的18S rDNA基因序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)差異[97]。從消減cDNA文庫(kù)中克隆和表達(dá)了與抗藥性相關(guān)的基因M20[97]。根據(jù)M20基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了SYBR Green real-time PCR和TaqMan Probe real-time PCR兩種用于檢測(cè)球蟲(chóng)抗藥性的方法，并用SYBR Green real-time PCR法對(duì)現(xiàn)場(chǎng)分離的球蟲(chóng)進(jìn)行抗藥性檢測(cè)[98]。用雙向電泳技術(shù)對(duì)2個(gè)抗藥株與敏感株的第二代裂殖子[99]和孢子化卵囊[100,101]進(jìn)行了蛋白質(zhì)差異分析，用質(zhì)譜技術(shù)分別鑒定了7個(gè)（地克珠利抗藥株4個(gè)、馬杜霉素抗藥株3個(gè)）差異明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過(guò)對(duì)2個(gè)抗藥株進(jìn)行基因重組獲得同時(shí)具備抗地克珠利和馬杜霉素的抗藥株重組體[102]，對(duì)雙重抗藥株、單重抗藥株和敏感株進(jìn)行了乳酸脫氫酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氨酸的同工酶分析[103]。這些研究為深入探討球蟲(chóng)的抗藥性機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

6 免疫預(yù)防

抗球蟲(chóng)藥的廣泛使用，對(duì)有效控制球蟲(chóng)病的危害，減少養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失發(fā)揮了重要作用。由于球蟲(chóng)抗藥性的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致藥物效果不斷下降，生產(chǎn)者往往不得不增加藥物的使用劑量，致使藥物在畜禽體內(nèi)的殘留超標(biāo)，為動(dòng)物源性食品安全帶來(lái)潛在威脅。免疫預(yù)防是球蟲(chóng)病防治的發(fā)展方向，既可改善球蟲(chóng)的抗藥性，又能避免藥物殘留。上海獸醫(yī)研究所在上世紀(jì)90年初就開(kāi)始了球蟲(chóng)病的免疫預(yù)防研究，觀察了NTG處理球蟲(chóng)誘導(dǎo)雛雞的保護(hù)性免疫[104]和腹腔注射短小棒狀桿菌誘導(dǎo)雛雞對(duì)球蟲(chóng)的免疫保護(hù)[105]，評(píng)估了雙重致弱球蟲(chóng)疫苗（DLV蟲(chóng)苗）在實(shí)驗(yàn)室和田間的免疫保護(hù)效果[106]，報(bào)道了6批中試產(chǎn)品在6個(gè)省市進(jìn)行的24批區(qū)域試驗(yàn)結(jié)果[107]，該疫苗于2000年獲得國(guó)家新獸藥證書(shū)[（2000）新獸藥證字第37號(hào)]，為國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)的第一個(gè)球蟲(chóng)疫苗，該項(xiàng)研究先后獲得1997年上?？茖W(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)（雞球蟲(chóng)病綜合免疫預(yù)防的研究）[108]、2003年上?？茖W(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)（雞球蟲(chóng)混合苗在集約化雞場(chǎng)的應(yīng)用）[109]、2003年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)技術(shù)成果一等獎(jiǎng)（雞球蟲(chóng)三價(jià)混合疫苗（DLV苗）免疫預(yù)防研究）[110]。后來(lái)，又開(kāi)展了球蟲(chóng)早熟株的選育工作，先后成功選育柔嫩艾美耳球蟲(chóng)早熟株[111]、堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株[112]、巨型艾美耳球蟲(chóng)早熟株[113]，其潛在期分別比母株縮短了23 h、15 h、35 h。進(jìn)行了3種球蟲(chóng)早熟株對(duì)8種抗球蟲(chóng)藥的敏感性試驗(yàn)，巨型艾美耳球蟲(chóng)早熟株對(duì)地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、馬杜霉素、鹽霉素和拉沙里菌素均敏感，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)早熟株對(duì)鹽霉素輕度敏感、另7種藥物敏感，堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株對(duì)鹽霉素輕度敏感、對(duì)二硝托胺不敏感、另6種藥物敏感[114,115]。研究了3種球蟲(chóng)早熟株的免疫劑量，通過(guò)免疫保護(hù)效果比較，推薦每羽雞接種卵囊劑量分別為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)早熟株600個(gè)、堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株600個(gè)、巨型艾美耳球蟲(chóng)早熟株200個(gè)[116-118]。此外，還完成了早熟株疫苗的懸浮液、保存條件、保存時(shí)間、配制工藝等研究，已取得的研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)球蟲(chóng)早熟株疫苗奠定了良好基礎(chǔ)。

7 體外培養(yǎng)

球蟲(chóng)的體外培養(yǎng)是研究球蟲(chóng)內(nèi)生發(fā)育、入侵機(jī)制、藥物篩選、蟲(chóng)株致弱等的重要技術(shù)平臺(tái)，包括雞胚傳代和細(xì)胞培養(yǎng)兩部分。上海獸醫(yī)研究所在上世紀(jì)80年代初就進(jìn)行了球蟲(chóng)的雞胚傳代研究，曾在雞胚中連續(xù)傳柔嫩艾美耳球蟲(chóng)120多代，測(cè)其致病性明顯減弱，但回雞后返強(qiáng)明顯。后又開(kāi)展了雞腎細(xì)胞繁殖球蟲(chóng)研究，成功在雞腎細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到柔嫩艾美耳球蟲(chóng)完整的內(nèi)生性發(fā)育階段，從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集的卵囊經(jīng)培養(yǎng)孢子化后感染雛雞獲得下一代卵囊[119]。為了提高雞胚培養(yǎng)球蟲(chóng)卵囊的收獲量，我們又對(duì)雞胚的接種日齡、子孢子接種量、胰島素和葉酸的添加量等進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，接種9日齡雞胚、每胚接種子孢子1×104個(gè)、在子孢子混懸液中加入胰島素1000 U/mL和葉酸0.05 mg/mL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，是毒害艾美耳球蟲(chóng)的雞胚培養(yǎng)適宜體系[120]；接種10日齡雞胚、每胚接種子孢子1×104個(gè)、在子孢子混懸液中加入胰島素100 U/mL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9 d，是柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的雞胚培養(yǎng)適宜體系[121]。首次將雞胚成纖維傳代細(xì)胞（DF-1）應(yīng)用于球蟲(chóng)培養(yǎng)，建立了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)DF-1細(xì)胞培養(yǎng)體系，通過(guò)對(duì)細(xì)胞鋪板量、子孢子接種劑量、培養(yǎng)基中胎牛血清濃度等的摸索，優(yōu)化了球蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)條件，并建立了流式細(xì)胞儀檢測(cè)子孢子入侵活力的方法，確定了檢測(cè)球蟲(chóng)子孢子入侵活力的最佳時(shí)間，比較了球蟲(chóng)子孢子對(duì)DF-1、MDBK（牛腎細(xì)胞）、Vero（猴腎細(xì)胞）、BHK（乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞）、MDCK（犬腎細(xì)胞）等5種細(xì)胞的入侵活力，觀測(cè)了不同濃度的子孢子多抗血清對(duì)子孢子入侵DF-1細(xì)胞的抑制情況[122]。目前，球蟲(chóng)體外培養(yǎng)技術(shù)已在球蟲(chóng)分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

8 分子生物學(xué)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)球蟲(chóng)的研究已從宏觀的普通生物學(xué)深入到微觀的分子生物學(xué)，上海獸醫(yī)研究所對(duì)球蟲(chóng)的研究也從流行病學(xué)調(diào)查與防治向核酸與蛋白質(zhì)擴(kuò)展。開(kāi)展了用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行球蟲(chóng)同工酶的初步研究[123]，檢測(cè)了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)未孢子化卵囊、孢子化卵囊、孢子囊的乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）、異檸檬酸脫氫酶（IDH）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6PGD）、磷酸葡萄糖變位酶（PGM）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（GPI）的同工酶[124]，研究了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、毒害艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)、變位艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)的LDH、GPI、G6PD、ALP、6PGD的同工酶[125]。利用RT-PCR方法擴(kuò)增、克隆了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子表面抗原基因（λMZ5-7）[126,127]和熱激蛋白（HSP）基因[128]，并在大腸桿菌中得到表達(dá)，經(jīng)檢測(cè)其重組蛋白具有抗原性，為進(jìn)一步研究這些基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)A08蛋白（EtA08）和棒狀體蛋白（EtRP）的單克隆抗體，用單抗對(duì)EtRP在子孢子中的分布進(jìn)行分子定位，觀測(cè)了經(jīng)單抗處理后對(duì)子孢子入侵細(xì)胞的影響，分析了EtA08基因在球蟲(chóng)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況，構(gòu)建了EtA08基因的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)[119-131]。制備了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶（EtLDH）單克隆抗體，用單抗對(duì)EtLDH在第二代裂殖子中的分布進(jìn)行了定位[132]。針對(duì)不同種雞球蟲(chóng)的保護(hù)性抗原基因不同，先后構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)[133]、堆型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)[134]、毒害艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)[135]、巨型艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊cDNA文庫(kù)[136]，對(duì)部分文庫(kù)進(jìn)行了抗原基因的篩選[137]，經(jīng)擴(kuò)增和序列分析，獲得堆型艾美耳球蟲(chóng)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因[138]和堆型艾美耳球蟲(chóng)1個(gè)新基因（GenBank登錄號(hào)：EU590120）[139]。為了篩選與雞球蟲(chóng)入侵和發(fā)育相關(guān)基因，構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子發(fā)育階段抑制性消減文庫(kù)[140]，利用抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）和cDNA微陣列技術(shù)，大規(guī)模篩選了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子和孢子化卵囊階段蟲(chóng)體差異表達(dá)基因，獲得了大量差異表達(dá)基因的ESTs序列（Genbank登錄號(hào)：ES346882～ES346911、ES351351～ES351428和GR935578～GR935588）[141]。根據(jù)ESTs序列，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增全長(zhǎng)基因獲得了11個(gè)含完整開(kāi)放閱讀框的新基因，對(duì)一些重要基因功能進(jìn)行了初步研究，包括EtSerpin[142]，EtAMA1[143]，EtCDPK3[144]，EtPDI[145]，EtLDH[146]，EteIF3[147]，EtCHP559[148]等。部分功能基因在原核表達(dá)系統(tǒng)或畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)或動(dòng)物細(xì)胞中獲得表達(dá)，包括新基因ZB7-C11（Genbank登錄號(hào)：GU553107）[149]、EtSAG[150]、新基因ZL583（Genbank登錄號(hào)：HQ877408）[151]、EteIF3d[152]、EtCDPK3[153,154]、EtRON2[155]、EtLDH[156]、EtSIR2[157]和EtSerpin[158]等，對(duì)獲得的部分重組蛋白進(jìn)行了免疫保護(hù)性初步研究。構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)子孢子[159]和裂殖子[160]酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，利用酵母雙雜交技術(shù)以EtAMA1為誘餌在構(gòu)建的子孢子文庫(kù)中篩選到與之相互作用的相關(guān)蛋白14個(gè)。對(duì)其中3個(gè)EST序列進(jìn)行擴(kuò)增，其基因全長(zhǎng)與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定分別為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保守假象蛋白（EtCHP559）[161]、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)胱硫醚β合成酶（EtCBS）[162]、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（EtSTK）[163]，分別構(gòu)建了這3個(gè)基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，在DF-1細(xì)胞中獲得表達(dá)。還構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鈣依賴蛋白激酶4（EtCDPK4）酵母雙雜交誘鉺質(zhì)粒，經(jīng)檢測(cè)沒(méi)有自激活活性和細(xì)胞毒性，能在酵母細(xì)胞中表達(dá)，為篩選EtCDPK4的互作蛋白奠定了基礎(chǔ)[164]。獲得這些與球蟲(chóng)入侵、發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵分子或基因，對(duì)進(jìn)一步探討球蟲(chóng)的入侵與內(nèi)生性發(fā)育機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的抗球蟲(chóng)疫苗候選分子和藥物作用靶標(biāo)等具有重要意義。

10 展望

回顧我所幾十年從事球蟲(chóng)生物學(xué)與球蟲(chóng)病防治研究的歷程，老一輩科學(xué)家注重科研與生產(chǎn)的結(jié)合，以解決養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中的難點(diǎn)作為科研攻關(guān)重點(diǎn)，在雞球蟲(chóng)病的藥物防治和免疫預(yù)防研究領(lǐng)域取得了輝煌業(yè)績(jī)；中青年一代繼承老一輩的優(yōu)良傳統(tǒng)，除繼續(xù)加強(qiáng)抗球蟲(chóng)新藥物和球蟲(chóng)疫苗研究外，在球蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查、球蟲(chóng)的純種建立與長(zhǎng)期保存、體外培養(yǎng)、抗藥性檢測(cè)、球蟲(chóng)入侵與發(fā)育相關(guān)基因的功能研究等方面也取得了長(zhǎng)足發(fā)展。展望未來(lái)，任務(wù)艱巨，還有許多難題需要青年一代去攻堅(jiān)克難。1）在球蟲(chóng)病藥物防治研究方面，由于新藥研制的周期長(zhǎng)、投入大，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)現(xiàn)場(chǎng)球蟲(chóng)的耐藥性監(jiān)測(cè)，制訂合理與合規(guī)的藥物使用程序，研究消除或延緩球蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生的方法，適當(dāng)研制與開(kāi)發(fā)現(xiàn)有藥物的新制劑，延長(zhǎng)現(xiàn)有抗球蟲(chóng)藥物的生命周期。2）在球蟲(chóng)病免疫預(yù)防研究方面，由于我國(guó)畜禽球蟲(chóng)種類多、分布廣，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)主要畜禽球蟲(chóng)病的多價(jià)弱毒活疫苗研究，同時(shí)積極篩選具有種、屬特征和較好免疫保護(hù)效果的抗原，尋找合適的多抗原表達(dá)載體，為研制球蟲(chóng)基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。3）在球蟲(chóng)的基礎(chǔ)研究方面，由于球蟲(chóng)具有較強(qiáng)的宿主特異性、組織特異性和細(xì)胞特異性，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)不同球蟲(chóng)的全基因組測(cè)序，尋找不同球蟲(chóng)侵入不同宿主和定位于不同組織與不同細(xì)胞的關(guān)鍵分子，為闡明球蟲(chóng)的入侵與發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)。4）在球蟲(chóng)的體外培養(yǎng)研究方面，繼續(xù)尋找或建立能用于體外完成整個(gè)球蟲(chóng)生活史的合適細(xì)胞株，為基因編輯技術(shù)有效用于球蟲(chóng)研究提供基礎(chǔ)。

球蟲(chóng)病仍是目前和未來(lái)較長(zhǎng)時(shí)間里嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要寄生蟲(chóng)病，上海獸醫(yī)研究所作為我國(guó)球蟲(chóng)與球蟲(chóng)病防治研究領(lǐng)域的國(guó)家隊(duì)，不論是基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究，都應(yīng)面向世界農(nóng)業(yè)科技前沿，面向國(guó)家重大需求，面向現(xiàn)代農(nóng)業(yè)建設(shè)主戰(zhàn)場(chǎng)，在國(guó)家實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中，為提升農(nóng)業(yè)發(fā)展質(zhì)量、促進(jìn)農(nóng)村社會(huì)穩(wěn)定、增加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。