豬源耐藥性大腸桿菌的分離與鑒定

李 杰 杭柏林董萌萌 寧春妹 司素錦 胡建和

（1河南省新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質量監(jiān)測檢驗中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

大腸桿菌是革蘭氏陰性細菌的典型代表，是人與動物及環(huán)境中的常見細菌[1-2]。某些致病性大腸桿菌菌株可導致宿主的疾病[3]。某些血清型的大腸桿菌可致仔豬的黃痢、白痢和水腫病[4-5]。使用抗生素是治療和預防豬大腸桿菌病的常用措施。而在實際生產(chǎn)中，抗生素的濫用或不正確使用常常導致大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性或超級細菌[6-8]。耐藥菌的出現(xiàn)給大腸桿菌病的治療和預防帶來了極大挑戰(zhàn)。因此，必須及時關注豬體內大腸桿菌的耐藥性情況，以期為豬大腸桿菌病的治療和預防提供參考。本試驗從腹瀉豬體內分離、鑒定到一株耐21種抗生素的大腸桿菌，為豬大腸桿菌病的預防和治療奠定了基礎，也提出了挑戰(zhàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2017年，5份糞便樣本采集自河南省南陽市某豬場腹瀉豬的十二指腸，4℃保存。

1.2 試劑與儀器

普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、伊紅美蘭（EMB）瓊脂、麥康凱（Maconkey）瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司，胰酶解酪蛋白大豆肉湯（TSB）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。綿羊血和革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司?？咕幬锼幟艏埰凹毦⒘可磻芫徸院贾菸⑸镌噭┯邢薰?。HBI腸桿菌科細菌生化鑒定條購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA分子量標準、細菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA純化回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。瓊脂糖購自上海藍季科技發(fā)展有限公司。pMD19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，大腸桿菌DH5a為本實驗室自行保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

恒溫培養(yǎng)箱（型號為DHP-9082），購自上海一恒科學儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌器（型號為LDFF-75KB），購自上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺（型號為SW-CJ-2F），購自蘇州凈化設備有限公司；PCR儀（型號為T-Gradient Thermoblock），購自德國Sartocon公司；電泳儀（型號為DYY-6C），購自北京市六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號為Universal Hood II），購自美國BIO-RAD公司；高速離心機（型號為D-37620），購自美國熱電公司；光學顯微鏡（型號為BA310Digital），購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.3 細菌的分離與培養(yǎng)

用滅菌的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）將糞便樣品稀釋100倍。將50 μL稀釋液加入含有普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用“L”型玻璃推棒涂布均勻。將接種后的培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約18～24 h。挑取可疑菌落在新培養(yǎng)基上進行劃線接種。如此操作，分離和傳代，革蘭氏染色后判定細菌純度。將分離的細菌與EMB瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和胰酶解酪蛋白大豆肉湯（TSB）一起培養(yǎng)，觀察其生長特征。

1.4 染色和形態(tài)觀察

用革蘭氏染色法和美蘭染色法[5]對分離的細菌進行染色，用光學顯微鏡（BA310Digital，Motic）觀察分離細菌形態(tài)，并拍照。

1.5 生理生化特性

按照生化發(fā)酵管和HBI生化鑒定條的說明書進行細菌生理生化試驗。細菌在TSB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18～24 h，再在TSB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3 h。將新鮮培養(yǎng)的細菌接種入生化發(fā)酵管和生化鑒定條中，置于37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察實驗結果。

1.6 16S rRNA PCR擴增與測序

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株的DNA，作為PCR擴增的模板。采用通用引物擴增分離菌株的16S rRNA基因。引物的序列為：8f：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 和 1492r：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’，預期片段大小為1 492bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增體系 （50 μL）：Rnase-free H2O 21 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各 1 μL，DNA模板2 μL。PCR反應參數(shù)：95℃預變性2 min，95℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并使用DNA純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收并連接pMD19-T載體，轉化入大腸桿菌DH5a中，將重組菌液送上海生工有限公司測序。

1.7 系統(tǒng)進化樹的構建

將測序所得基因序列與GenBank公布的各株大腸桿菌16S rRNA基因序列進行BLAST比對，利用DNAStar軟件中Jotun Hein方法構建系統(tǒng)進化樹。

1.8 藥敏試驗

按照藥敏紙片說明書進行分離細菌的藥敏試驗。取100 μL對數(shù)期的分離細菌(1×108CFU/mL)用“L”型推棒均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂上，用無菌鑷子貼藥敏紙片于瓊脂表面，37℃培養(yǎng)24 h，參照CLSI（2014）標準進行結果判定[9]。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離結果

經(jīng)多次分離、傳代，成功從5份豬糞樣本中分離、純化得到1株細菌。分離細菌，經(jīng)美蘭染色后，菌體呈藍色、桿狀(如圖1B)，經(jīng)革蘭氏染色后，菌體呈紅色、桿狀(如圖1A)。這表明，成功從樣本中分離到1株革蘭氏陰性桿菌。

2.2 細菌的培養(yǎng)特性

將分離的細菌在不同培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，結果如圖2所示。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，分離細菌長成圓形、白色的菌落（如圖2A）；在伊紅美蘭瓊脂上，分離細菌長成圓形、黑色、帶金屬光澤的菌落（如圖2B）；在綿羊血瓊脂上，分離細菌長成圓形、白色的菌落，沒有溶血現(xiàn)象（如圖2C）；在SS瓊脂上，分離細菌長成圓形、紅色的菌落（如圖2D）；在麥康凱培養(yǎng)基上，分離細菌長成圓形、紅色的菌落（如圖2E）；在TSA液體培養(yǎng)基中，經(jīng)18 h左右的培養(yǎng)，整個菌液呈均勻渾濁狀（如圖2F）。分離細菌的培養(yǎng)結果與大腸桿菌的基本特性相符合。

圖1 細菌的染色與形態(tài)觀察 （×1 000）

圖2 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的生長特性

2.3 細菌的生理生化結果

將分離細菌進行生化試驗，結果如表1所示。分離細菌能發(fā)酵甘露醇、麥芽糖、蕈糖、乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，半固體穿刺、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、吲哚、MR、山梨醇、蜜二糖、棉子糖、七葉苷、乳糖的試驗結果呈陽性，西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、VP、苯丙氨酸、肌醇、核糖醇、水楊素、尿素的試驗結果呈陰性。參照文獻[10]，符合大腸桿菌的生化特性。

2.4 PCR擴增及測序

通過PCR擴增分離細菌的16S rRNA基因序列，結果符合預期1 506 bp的擴增片段長度(如圖3)。

圖3 分離細菌的PCR擴增結果

2.5 16S rRNA的同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將測定的分離細菌的16S rRNA基因序列輸入GenBank中進行BLAST比對分析，結果與大腸桿菌豬肉源 （CP025318株）、犬源 （CP023359株、CP010134株）、人源（CP022407株、CP018948株、CP023349株）的同源性均高達99.8%。根據(jù)不同屬細菌16S rRNA基因同源性為70%～90%，而同一種內不同株間基因同源性＞99%[11]，結合上述分離細菌的染色特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征，可以認為分離細菌為大腸桿菌，暫命名為ZB17090404326。

表1 分離菌株的生化試驗結果

通過鄰近法構建分離菌株ZB17090404326的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果如圖5所示。從圖5中可以看出，分離菌株ZB17090404326與豬大腸桿菌CP025753株的親緣關系最近，所有參與構建進化樹的大腸桿菌菌株形成2個主要分支，分離菌株ZB17090404326單獨形成1個分支。這表明，分離菌株ZB17090404326是一個獨特的大腸桿菌分離株。

圖4 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性比較結果

2.6 藥敏試驗結果

將分離菌株ZB17090404326進行藥物敏感性測定，結果如表2所示。從表2中可以看出，在測定的26種藥物中，分離細菌對21種藥物耐藥，對4種藥物敏感。這表明分離菌株ZB17090404326為高耐藥性細菌。

圖5 分離菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹

3 討論

細菌的分離是從細菌的混合物中獲得某種細菌的純化物。只有獲得純化細菌，方可進行細菌的系統(tǒng)性鑒定[12]。而細菌的鑒定是一項系統(tǒng)工作，常需要檢測許多項目，如形態(tài)觀察、染色特性、培養(yǎng)特性、生化與生態(tài)特性、血清型鑒定、細菌毒力測定、核酸檢測等。一般講，細菌鑒定至少需要同時驗證3種指標[12]。形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性和生化特性等的觀察是細菌鑒定過程中最常用的方法。但現(xiàn)在細菌鑒定過程中，還常借助細菌16S核糖體RNA（ribosome RNA，rRNA）的測定。因為細菌16S rRNA是細菌進化過程中最為保守的基因，是細菌鑒定時常用的PCR擴增序列[13-14]。細菌16S rRNA基因可變區(qū)因細菌不同而異，是細菌分類的分子基礎，而其保守區(qū)的序列在不同細菌間基本相同，可反映細菌間的親緣關系[15]。因此，通過細菌16S rRNA基因序列的分析，可對分離的細菌進行鑒定，同時了解其演化特征。本研究通過細菌形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性和生化特性的觀察，并結合16S rRNA序列的比對分析，鑒定從腹瀉豬十二指腸中分離的細菌為大腸桿菌。

細菌的耐藥性有單耐藥和多重耐藥。多重耐藥性細菌對疾病的預防和治療提出了挑戰(zhàn)與考驗。目前，大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為多見。賀丹丹等[16]對2011—2012年從患病和健康食品動物中分離鑒定到的935株大腸桿菌的耐藥性進行調查，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對15種抗菌藥物中的大部分藥物的耐藥率超過70%，以耐6～10種抗菌藥物的菌株數(shù)量最多，并有1株大腸桿菌能耐15種抗菌藥物。而在本研究中，分離的大腸桿菌能耐21種抗菌藥物。細菌的耐藥性主要有固有耐藥和獲得性耐藥[17]。獲得性耐藥是細菌形成耐藥性的主要原因[18]。而大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生也與長期使用抗生素有關[19]。細菌在抗生素選擇壓力下，為了生存而與抗生素對抗，通過改變新陳代謝或獲得耐藥性元件，從而形成獲得性耐藥。Collignon等[20]認為減少抗生素的使用不足以控制耐藥性，而耐藥菌株和耐藥基因的傳播是耐藥性嚴重的主要因子。耐藥基因的獲得是細菌獲得新耐藥特性的重要因素。隨著時間推移，大腸桿菌的耐藥率越來越高，耐藥譜越來越寬，多重耐藥菌株越來越多[21]。大腸桿菌的耐藥性情況已經(jīng)越來越嚴峻，對人類與動物的健康造成了巨大威脅[6]。因此，加強大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生意義。

表2 細菌的藥敏試驗結果