不同顏色花生種皮色素提取工藝研究

林 茂，趙景芳，鄭秀艷，孟繁博，李國(guó)林，黃道梅，陳 曦，蔣 力

(貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所/貴州省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

花生(ArachishypogaeaL.)是豆科作物，最早起源于南美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，約16世紀(jì)初由葡萄牙人傳入我國(guó)，在19世紀(jì)末期得到了空前發(fā)展[1]。迄今，全世界已有100多個(gè)國(guó)家種植花生，總種植面積超過(guò)2000萬(wàn)公頃，主要分布于亞洲、非洲和美洲，而歐洲和大洋洲僅有零星種植[2]。2017年我國(guó)花生種植面積540萬(wàn)hm2[3]，產(chǎn)量預(yù)計(jì)為20 Mt，其中接近50%的花生用于榨油，加工過(guò)程中必然會(huì)產(chǎn)生花生外殼和種皮等副產(chǎn)物，全世界每年約有750 kt花生種皮產(chǎn)生[4]，而我國(guó)約有600 t。在我國(guó)，花生種皮中只有少部分被用來(lái)制藥，大部分均被當(dāng)作飼料使用，造成資源極大浪費(fèi)[5]?；ㄉN皮中除了含有多種營(yíng)養(yǎng)成分外，還富含白藜蘆醇、原花色素、花色苷等多種生理活性成分，具有清除自由基、抗癌、降血壓等作用[6-10]。對(duì)花生種皮進(jìn)行深入的研究，將其多種活性成分分離提取出來(lái)應(yīng)用于其他相關(guān)領(lǐng)域，不僅可提高花生的綜合利用價(jià)值，而且可變廢為寶，增加花生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，增加農(nóng)民的收入。

花生種皮色素和其他植物色素的提取方法一樣，主要有溶劑提取、超聲波提取、微波提取、超臨界提取等[11-13]方法，其中溶劑提取法是最常用的。本研究針對(duì)粉紅色和紫黑花生種皮色素的提取，采取單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，為不同種皮花生色素的提取工藝優(yōu)化和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

1.1.1 材料

2種不同種皮顏色花生由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品質(zhì)資源研究所提供，分別是種皮顏色為粉紅色的銅仁珍珠花生和種皮顏色為紫黑色的紫魁花生；2種試驗(yàn)花生全部在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地種植繁殖。種植方式：每個(gè)材料種植30行，每行10穴，行距40 cm，穴距18 cm，雙粒播種，小區(qū)設(shè)3個(gè)重復(fù)，田間采用相同管理。待花生成熟后，兩端除去邊際效應(yīng)的兩穴，其余材料全部收獲。收獲的材料自然晾干(水分含量<10%)，除去外殼表層雜質(zhì)，選取果形大小和成熟度一致的莢果，裝入密封玻璃瓶中，置于低溫低濕種子柜中(溫度5～8℃、濕度40%～50%)密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

乙醇、甲醇、甲酸為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；抑制超氧陰離子試劑盒、總抗氧化性試劑盒和抑制羥自由基試劑盒為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.1.3 儀器設(shè)備

FA2004分析天平：上海精密科學(xué)儀器公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上?？茖W(xué)儀器有限公司；ModulyoD真空冷凍干燥器：Thermo Fisher公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵：上海亞榮生化儀器廠；TYS-100粉碎機(jī)：浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電公司；HH-6恒溫水浴鍋：江蘇智金富華儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 花生種皮制備

參考曹凱光等[5]關(guān)于花生種皮制備方法，首先將花生籽仁經(jīng)50℃烘干，人工剝離種皮后用粉碎機(jī)粉碎，放置4℃冰箱備用。

1.2.2 色素得率的計(jì)算

花生種皮在相應(yīng)提取方法下提取色素，提取液濃縮后真空冷凍干燥，稱質(zhì)量。按下列公式計(jì)算色素得率：

式中m種皮為種皮質(zhì)量，m色素為真空冷凍干燥后色素的質(zhì)量。

1.2.3 提取溶劑篩選

考察乙醇、水、甲醇和丙酮對(duì)花生種皮色素提取的影響，以色素得率為指標(biāo)篩選出最適提取溶劑，固定提取時(shí)間70min，料液比1∶50，溫度60℃。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

依據(jù)提取溶劑篩選結(jié)果，選擇乙醇為最適提取溶劑，考察不同乙醇濃度(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)、不同提取溫度/℃(30、40、50、60、70、80)、不同提取時(shí)間/min(40、60、80、100、120、140)和不同料液比/mL(100、200、300、400)對(duì)色素得率的影響，提取液濃縮后真空冷凍干燥，稱質(zhì)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。紫魁花生種皮色素提取條件的優(yōu)化：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)原理[14]，選取對(duì)色素得率影響較大的乙醇濃度(A1)、提取溫度(B1)、提取時(shí)間(C1)、料液比(D1)4個(gè)因素為變量，每一個(gè)自變量取高(1)、中(0)、低(-1)三個(gè)水平進(jìn)行編碼，以色素得率為響應(yīng)值(Y紫魁)，進(jìn)行四因素三水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，對(duì)紫魁花生種皮色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平編碼見(jiàn)表1。

銅仁珍珠花生種皮色素提取條件的優(yōu)化：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)原理，選擇對(duì)色素得率具有顯著影響的乙醇濃度(A2)、溫度(B2)、時(shí)間(C2)、料液比(D2)4個(gè)因素為變量，每一個(gè)自變量取高(1)、中(0)、低(-1)三個(gè)水平進(jìn)行編碼，以色素得率為響應(yīng)值(Y銅仁珍珠)，進(jìn)行4因素3水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，對(duì)銅仁珍珠花生種皮色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平編碼見(jiàn)表2。

1.2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，Origin 8.1軟件畫(huà)圖。

表1 紫魁花生種皮色素響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

表2 銅仁珍珠花生種皮色素提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

圖1 不同提取溶劑對(duì)花生種皮色素得率的影響Fig.1 The effect of solvents on pigments extraction rate

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)花生種皮色素提取的影響

分析了水、乙醇、甲醇和丙酮作為提取溶劑提取花生種皮色素的影響(圖1)，結(jié)果表明，不同提取溶劑對(duì)種皮色素的提取具有一定差異。水作為提取溶劑時(shí)，色素得率最低，而甲醇、丙酮和乙醇作為溶劑時(shí)，差異不明顯，從安全性和環(huán)保角度考慮，選用乙醇作為最適提取溶劑。劉大川等[15]的原花色素的提取試驗(yàn)中，提取溶劑的選擇也有相同的結(jié)論。

2.2 不同提取因素對(duì)花生種皮色素提取效果的影響

通過(guò)分析不同乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)色素得率的影響(圖2)，結(jié)果表明，紫魁花生種皮色素提取中可知，乙醇濃度為30%～60%的色素得率明顯高于20%、70%，組間顯著性差異分析同樣表明，乙醇濃度為30%、40%、50%、60%與20%、70%具有顯著性差異，綜合考慮選擇乙醇濃度范圍為30%～50%；提取時(shí)間范圍設(shè)置為40、60、80、100、120、140 min。從圖中提取時(shí)間的考察數(shù)據(jù)顯示，80～140 min時(shí)色素得率較高，組間差異性分析表明60 min和80 min之間存在顯著性差異，而80～140 min之間沒(méi)有顯著性差異，因此，選擇提取時(shí)間范圍為70～90 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化；從圖2中提取溫度對(duì)紫魁花生種皮色素提取得率的影響可知，70 ℃和80 ℃的提取效果最佳，并且與60 ℃具有顯著性差異，因此選擇提取溫度范圍為60～80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化；從料液比對(duì)色素提取效果的影響看，1∶60的提取效果最佳，并且1∶60與1∶40和1∶80具有顯著性差異，從節(jié)約提取溶劑方面考慮，選擇料液比范圍為1∶40～1∶60。銅仁珍珠花生的種皮色素提取工藝中可知，乙醇濃度為50%的色素得率明顯高于其他濃度，組間差異性分析也表明50%乙醇濃度提取色素得率與40%和60%具有明顯差異，綜合考慮選擇乙醇濃度范圍為40%～60%；提取時(shí)間/min 范圍設(shè)置為40、60、80、100、120、140。從圖中提取時(shí)間的考察數(shù)據(jù)顯示，80 min時(shí)色素得率較高，組間差異性分析表明60 min與80 min之間沒(méi)有顯著性差異，但是80 min與40 min之間存在顯著性差異，因此，選擇提取時(shí)間范圍為60～80 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化；從圖2中提取溫度對(duì)銅仁珍珠花生種皮色素提取得率的影響可知，70 ℃和80 ℃的提取效果最佳，并且與60 ℃具有顯著性差異，因此選擇提取溫度范圍為60～80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化；從料液比對(duì)色素提取效果的影響來(lái)看，1∶80的提取效果最佳，并且1∶80與1∶60和1∶100具有顯著性差異，從節(jié)約提取溶劑方面考慮，選擇料液比范圍為1∶50～1∶70。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of single factor test

2.3 不同種皮顏色花生種皮色素提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.1 紫魁花生種皮色素提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度30%～50%(A1)、提取溫度60～80℃(B1)、提取時(shí)間70～90min(C1)和料液比1∶40～1∶60g/mL(D1)4個(gè)因素為變量，以色素得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)優(yōu)化紫魁種皮色素提取條件。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

利用Design Expert 8.0.6.1軟件處理所得數(shù)據(jù)[16]，得到紫魁種皮色素提取預(yù)測(cè)的二次多元回歸模型為：Y紫魁=0.418-0.042A1+0.17B1+0.39C1+0.17D+0.075A1B1+0.15A1D1+0.32B1C1-0.15B1D1-0.10C1D1-0.70A12-0.66B12-0.90C12-0.34D12。

由表4可知，模型p<0.0001，F(xiàn)=53.15>F0.01(14,4)=14.24，表明該模型極顯著；模型的R2=98.15%，說(shuō)明該模型可以預(yù)測(cè)98.15%響應(yīng)值的變化；變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，本研究中的CV值為4.02%，說(shuō)明模型方程能夠較好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值；銅仁珍珠種皮色素提取模型的信噪比(Adeq Precision)為23.640>4，說(shuō)明模型可以用于實(shí)際預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)p=0.1752>0.05，F(xiàn)=2.70D1>B1>A1，即提取時(shí)間>料液比>提取溫度>乙醇濃度。

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖(圖3)，曲面圖的形狀可反應(yīng)出因素間交互作用對(duì)色素得率的影響，曲面越陡峭，影響越顯著，擬合的響應(yīng)面圖和等高線圖比較直觀地反映了各因素間的交互作用。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。等高線的顏色變化也能反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，顏色對(duì)比強(qiáng)烈，說(shuō)明交互作用顯著。此外，響應(yīng)面最高點(diǎn)與對(duì)應(yīng)等高線的最小橢圓中心點(diǎn)即極值點(diǎn)，而且回歸方程中的系數(shù)有正有負(fù)，說(shuō)明存在極大值點(diǎn)[19]。圖3a中可看出，乙醇濃度與料液比的交互作用顯著，圖3b中可看出提取溫度與提取時(shí)間的交互作用極顯著，圖3c可看出溫度與料液比的交互作用顯著。

表3 紫魁種皮色素提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 紫魁種皮色素提取響應(yīng)面結(jié)果方差分析

注：**表示差異極顯著(p<0.01)，*表示差異顯著(0.01

Note: ** indict significance of difference atp<0.01, and * indict significance of difference at 0.01

圖3 紫魁種皮色素提取條件中各因素的交互作用影響的響應(yīng)面圖Fig.3 The interactive effects among the factors of pigments extraction of ZiKui peanut skin

根據(jù)二次多元回歸模型，優(yōu)化得到紫魁種皮色素提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度39.98%、提取溫度71.64 ℃、提取時(shí)間84.74 min、料液比1∶53.48，在該條件下，依據(jù)模型，預(yù)測(cè)紫魁種皮色素得率為4.25%。為便于實(shí)際試驗(yàn)操作，將紫魁種皮色素得率的最佳工藝條件修正為：乙醇濃度40%、提取溫度72 ℃、提取時(shí)間85min、料液比1∶54，在此條件下紫魁種皮色素得率為4.18%，與理論值4.25%相比，相對(duì)誤差為1.67%。因此，通過(guò)采用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化紫魁種皮色素的提取條件，所得最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3.2 銅仁珍珠花生種皮色素提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 銅仁珍珠種皮色素提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 銅仁珍珠種皮色素提取響應(yīng)面結(jié)果方差分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度40%～60%(A2)、提取溫度60～80℃(B2)、提取時(shí)間60～80min(C2)和料液比1∶50～1∶70(D2)4個(gè)因素，以色素得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)優(yōu)化銅仁珍珠花生種皮色素提取條件。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

利用Design Expert 8.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，得到色素得率預(yù)測(cè)的二次多元回歸模型為：Y銅仁珍珠=3.24-0.03A2+0.05B2-0.025C2+0.12D2-0.025A2B2-0.025A2C2-0.075A2D2+0.20B2C2-0.13B2D2-0.10C2D2-0.37A22-0.16B22-0.32C22-0.54D22。

表6可知，模型p<0.0001，F(xiàn)=46.58>F0.01(14,4)=14.24，表明該模型極顯著；R2=97.90%，說(shuō)明該模型可以預(yù)測(cè)97.90%響應(yīng)值的變化；變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高，本研究中的CV值為2.2%，說(shuō)明模型方程能較好的反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值；銅仁珍珠種皮色素提取模型的信噪比(Adeq Precision)為25.829>4，說(shuō)明模型可用于實(shí)際預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)p=0.2989>0.05，F(xiàn)=1.81B2>C2>A2，即料液比>提取溫度>提取時(shí)間>乙醇濃度。

圖4 銅仁珍珠花生種皮色素提取條件中各因素的交互作用Fig.4 The interactive effects among the factors of pigments extraction of Tongren peanut skin

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖。分析了乙醇濃度和料液比交互作用的響應(yīng)曲面圖(圖4a)，從其等高線可以直觀的看出兩因素的交互作用顯著，等高線沿料液比軸變化相對(duì)密集，說(shuō)明料液比對(duì)色素得率的影響比乙醇濃度大；分析了提取時(shí)間和提取溫度交互作用的響應(yīng)曲面圖(圖4b)，從其等高線可以直觀的看出兩因素的交互作用顯著，等高線沿溫度軸變化相對(duì)密集，說(shuō)明提取溫度對(duì)色素得率的影響比時(shí)間大；分析了提取溫度和料液比交互作用的響應(yīng)曲面圖(圖4c)，從其等高線可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著，等高線沿料液比軸變化相對(duì)密集，說(shuō)明料液比對(duì)銅仁珍珠花生種皮色素得率的影響比提取溫度大；分析了料液比和提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)曲面圖(圖4d)，從其等高線可以直觀地看出兩因素的交互作用顯著，等高線沿料液比軸變化相對(duì)密集，說(shuō)明料液比對(duì)色素得率的影響比提取時(shí)間大。

根據(jù)二次多元回歸模型，優(yōu)化得到銅仁珍珠花生種皮色素提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度49.76%、提取溫度71.06 ℃、提取時(shí)間69.59 min、料液比1∶61.99，在該條件下，模型預(yù)測(cè)色素得率為：3.24%。為便于實(shí)際試驗(yàn)操作，將銅仁珍珠花生種皮色素的最佳工藝條件修正為：乙醇濃度50%、提取溫度71℃、提取時(shí)間70min、料液比1∶62。在此條件下測(cè)得種皮色素得率為3.19%，與理論值3.24%相比，相對(duì)誤差為1.54%。因此，進(jìn)一步證實(shí)采用響應(yīng)面法優(yōu)化銅仁珍珠花生種皮色素的提取條件，所得最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 討論與小結(jié)

實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定了銅仁珍珠花生和紫魁花生種皮色素溶劑提取的最佳工藝。紫魁花生種皮色素最佳提取工藝為：乙醇濃度40%、提取溫度72 ℃、提取時(shí)間85 min、料液比1∶54，在此提取條件下色素得率為4.18%；銅仁珍珠花生種皮色素最佳提取工藝為：乙醇濃度50%、提取溫度71 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比1∶62，在此提取條件下色素得率為3.19%。結(jié)果顯示，紫黑色花生種皮和粉紅色花生種皮色素提取工藝條件有一定差異，且紫黑花生種皮色素含量較粉紅色花生種皮色素高。