人源腫瘤組織異種移植在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用進(jìn)展*

張學(xué)浩，徐燦，方川

（1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科， 河北 保定 071002）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的50%以上。根據(jù)組織學(xué)和病理特征特點(diǎn)，世界衛(wèi)生組織將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ 級(jí)[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）是最具侵襲性的原發(fā)性惡性腦腫瘤。目前治療的標(biāo)準(zhǔn)方案方案包括手術(shù)切除，其次是放化療。但這些積極的治療方案中，GBM 患者平均生存期僅為1 ～2年[2]，如此低的生存率，需要一種新的治療策略。人源腫瘤組織異種移植（patient derived xenograft,PDX）是完成這項(xiàng)任務(wù)的一個(gè)有價(jià)值的工具，用于預(yù)測(cè)治療結(jié)果及規(guī)劃患者的個(gè)體治療，以便為GBM 患者確定最佳的治療方案。

1 PDX 模型及復(fù)制的方法

PDX 模型是指直接將手術(shù)切除患者的新鮮腫瘤組織或細(xì)胞、活檢組織或細(xì)胞通過異位或者原位移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)的一種異種移植模型，依賴于小鼠提供的環(huán)境[3]。PDX 的最大優(yōu)點(diǎn)是模型保留原始腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，繼承原發(fā)腫瘤的所有分子生物學(xué)特性，保留腫瘤的異質(zhì)性[4]。PDX 對(duì)篩選抗腫瘤藥物和預(yù)測(cè)患者療效、吸收率及副作用等也很重要[5]。目前，PDX 模型與臨床研究的相關(guān)腫瘤極為接近，模型對(duì)腫瘤臨床前期評(píng)估、治療和預(yù)后具有重要的轉(zhuǎn)化意義，有望為腫瘤患者個(gè)體化治療帶來新突破。大量研究表明，PDX 模型具有高度保真度，可保留原發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)、遺傳特征及腫瘤異質(zhì)[6]。

PDX 模型可采取原位移植腫瘤組織和異位移植腫瘤組織。①原位移植移植模型：將腫瘤組織因移植到原位，由于被移植部位與原始腫瘤所處的微環(huán)境差異小，原位移植被認(rèn)為更具有移植優(yōu)勢(shì)。然而，這種類型的移植對(duì)操作技能、支出及觀察腫瘤的方法有更高要求[7]。②異位移植腫瘤模型：將腫瘤組織種植入到小鼠背部皮膚下或腎包膜下，該種方法不僅可以提高腫瘤形成率，而且可以縮短腫瘤形成時(shí)間，且操作較原位移植簡(jiǎn)單，觀察和測(cè)量更為方便[8]。

用于復(fù)制PDX 模型的小鼠根據(jù)免疫缺陷程度可以分為T 淋巴細(xì)胞缺陷小鼠（BAL B/C 小鼠）、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞雙缺陷小鼠（SCID 小鼠）、非肥胖糖尿病T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞雙缺陷小鼠（NODSCID 小鼠）、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及NK 細(xì)胞缺陷小鼠（NSG 小鼠、NOG 小鼠）。其中，NSG 小鼠是目前國(guó)際公認(rèn)的具有最高免疫缺陷程度，且最適合人細(xì)胞或組織移植的小鼠。

膠質(zhì)瘤PDX 復(fù)制方法：①采用外科手術(shù)、組織及活檢等方法，采集一部分腦膠質(zhì)瘤的組織標(biāo)本，將其余腦膠質(zhì)瘤組織置于甲醛溶液中冷凍保存，待用分析；②將采集的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本行去除壞死組織等預(yù)處理后，用無菌手術(shù)刀將膠質(zhì)瘤組織切成小塊（1 ～3 mm3）或?qū)⒔M織制備單細(xì)胞懸液；③將處理好的膠質(zhì)瘤組織移植到免疫缺陷小鼠中，通常將腫瘤組織移植于小鼠背部皮下；④將荷鼠置于特定的無病原體環(huán)境中，飼養(yǎng)荷成瘤小鼠4 ～6 個(gè)月。當(dāng)腫瘤體積增加至1 ～2 cm3時(shí)處死小鼠，取出腫瘤并標(biāo)記為F0；⑤重復(fù)上述步驟，將F0 代腫瘤移植于其他免疫缺陷小鼠體內(nèi)，復(fù)制F1 代移植瘤小鼠，逐漸傳代移植；⑥以此為模型，進(jìn)行膠質(zhì)瘤方面的研究，以便為患者確定最佳的治療方案。

2 PDX 模型在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用及研究 進(jìn)展

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，其中GBM 惡性程度最高。盡管有許多積極的治療方案，但是GBM 仍然是致命的腦腫瘤。為實(shí)現(xiàn)有針對(duì)性的治療方案，開發(fā)新的治療腦腫瘤策略是一個(gè)緊迫的任務(wù)，復(fù)制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤PDX 模型并在該P(yáng)DX 中進(jìn)行相應(yīng)的研究必不可少。為實(shí)現(xiàn)更好的個(gè)性化治療策略和了解發(fā)病機(jī)制，需要從GBM 模型和足夠數(shù)量的腫瘤材料來進(jìn)行詳細(xì)的分子水平和功能分析，以便為GBM 患者確定最佳的治療方案。WILLIAM 等[9]用替莫唑胺、依維莫司、索拉非尼、鹽霉素及貝伐單抗或伊立替康單藥治療5 種不同的GBM PDX 模型（每組5 只），對(duì)照組用生理鹽水處理；5 例PDX 模型中有4 例對(duì)替莫唑胺單藥敏感，只有1 例表現(xiàn)出內(nèi)在耐藥；抗VEGF 抗體貝伐單抗治療效果良好，均為陽性；應(yīng)用拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑伊立替康3 例有效；mTOR 抑制劑治療對(duì)2 例有效；多激酶抑制劑索拉非尼對(duì)1 例有效，而鹽霉素對(duì)所有病例均無影響；此外，所有經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理的PDX 模型都通過面板測(cè)序分析可能的相關(guān)突變，涉及48 個(gè)癌癥相關(guān)基因的212 個(gè)靶區(qū)。GUPTA 等[10]將28 例GBM PDX作為原位異種移植體（每組8 ～10 只），比較替莫唑胺與替莫唑胺/卡鉑聯(lián)合使用的療效，結(jié)果是替莫唑胺和卡鉑的聯(lián)合使用與單獨(dú)使用替莫唑胺相比較，聯(lián)合應(yīng)用能延長(zhǎng)GBM 模型的存活時(shí)間，從而進(jìn)一步得出卡鉑對(duì)MGMT 啟動(dòng)子甲基化的腫瘤有促進(jìn)作用。KARPELMASSLER 等[11]研究表明，小分子抑制劑WP 1130（一種干擾USP9X 功能的去泛素酶抑制劑）會(huì)降低已復(fù)制成功的GBM PDX 和干細(xì)胞樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力，表明靶向去泛素酶治療膠質(zhì)瘤可行、有效。MICHELHAUGH 等[12]復(fù)制膠質(zhì)瘤和轉(zhuǎn)移性腦腫瘤（來自肺癌和乳腺癌）的移植瘤小鼠模型，用18F-FETrp 和11C-AMT 對(duì)離體1 ～7 d 荷瘤小鼠進(jìn)行PET 動(dòng)態(tài)掃描；比較2 種示蹤劑的生物分布和腫瘤小型單層水泡（SUVs），證明用18F-FETrp與11C-AMT 這兩種示蹤劑進(jìn)行PET 掃描在小鼠模型中的生物分布的典型表現(xiàn)有一定的不同。因此，在腦膠質(zhì)瘤方面也是一個(gè)很有價(jià)值的研究工具，用于腦膠質(zhì)瘤臨床前藥物測(cè)試、新藥開發(fā)及個(gè)體化藥物篩選，也可進(jìn)行分子生物學(xué)和影像學(xué)的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌、胰腺癌患者與相應(yīng)的PDX 模型對(duì)西妥昔單抗和吉西他濱表現(xiàn)出相同的反 應(yīng)[13-15]。葛曉梅等[16]研究裸鼠皮下移植復(fù)制胃癌PDX模型，并在該模型上進(jìn)行化療藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)，證明PDX 模型為胃癌的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)提供更多工具。孫夢(mèng)熊等[17]復(fù)制性骨與軟組織肉瘤患者來源移植瘤模型，將成瘤的PDX 小鼠分組，每組3 只。不同組別給予不同的化療藥物，根據(jù)化療藥物的特點(diǎn)給藥，通過T/C 計(jì)算抑制率，比較得出PDX 模型敏感藥物及不敏感藥物，并與對(duì)應(yīng)的患者用藥情況進(jìn)行比較，證實(shí)PDX 模型對(duì)化療的敏感性與臨床實(shí)際療效具有較好的相符合性。其中，阿帕替尼、安羅替尼、索拉菲尼及多西他賽對(duì)PDX 模型敏感，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。BERTOTTI 等[15]發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）抑制劑西妥昔單抗用于47 例結(jié)腸癌PDX 模型，有效反應(yīng)率為10.6%，與結(jié)腸癌患者用藥相似。因此，根據(jù)個(gè)體化PDX 模型對(duì)藥物的反應(yīng)，臨床醫(yī)生可以為患者選擇并確定最佳的治療方案或?qū)χ委煼桨高M(jìn)行優(yōu)化，而研究人員可以進(jìn)行新藥的開發(fā)。

PDX 模型在藥物篩選研究中扮演重要角色，又有助于對(duì)腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物的研究。ZHANG 等[18]在胃癌PDX 模型中進(jìn)行西妥昔單抗實(shí)驗(yàn)，約30% PDX模型腫瘤顯示部分或完全消退。從分子生物學(xué)、RNA轉(zhuǎn)錄水平、組織學(xué)水平及EGFR 途徑相關(guān)基因突變的檢查等方面，探究西妥昔單抗處理胃癌PDX 模型后EGFR 的表達(dá)水平和突變情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)該藥物有反應(yīng)的PDX 模型具有更高水平的EGFR 表達(dá)。方天 等[19]復(fù)制肺癌PDX 模型，用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)原代組織和F3 代組織標(biāo)本內(nèi)P63、napsinA 及TTF-1表達(dá)水平的差異性。P63 蛋白在肺鱗癌患者及其PDX模型癌細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。在肺腺中極少數(shù)表達(dá)（＜5%）。Napsin A 蛋白在肺鱗癌患者及其第3 代PDX模型癌細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，但在肺腺癌的表達(dá)與之相反。TTF-1 蛋白在肺鱗癌及腺癌患者癌細(xì)胞和其第3代PDX 模型癌細(xì)胞中表達(dá)不同，鱗癌呈陰性表達(dá)，而肺腺癌呈強(qiáng)陽性表達(dá)。WU 等[20]成功復(fù)制食管鱗癌PDX 模型，并證實(shí)分子靶向藥赫賽汀能抑制人表皮生長(zhǎng)因子受體2 高表達(dá)的食管鱗癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)。因此，可以通過PDX 模型，評(píng)估分子生物學(xué)特性、檢測(cè)生物標(biāo)志物，進(jìn)行腫瘤相關(guān)分子的研究。

隨著生物庫或PDX 腫瘤生物樣本庫的建立，將使腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療將變成現(xiàn)實(shí)[5]?？蒲腥藛T已經(jīng)利用PDX 模型驗(yàn)證多種已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的癌癥敏感性生物標(biāo)志物，如野生型KRAS 的結(jié)直腸癌及肺癌分別對(duì)西妥昔單抗和厄洛替尼敏感[8、13]。

3 PDX 模型的局限性和展望

雖然PDX 模型保留原代生物學(xué)特性、腫瘤異質(zhì)性、基因組結(jié)構(gòu)及藥敏反應(yīng)，但是把腫瘤移植到有免疫缺陷的小鼠身上時(shí)，腫瘤的分布及特點(diǎn)依然與患者原始腫瘤不同；其次，人源腫瘤淋巴瘤在小鼠內(nèi)形成這是PDX 模型的一個(gè)主要問題，這種現(xiàn)象多次被報(bào)道，其中包括前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌和胃癌的PDX 模型[21-24]；最后，復(fù)制和維持的成本較高，復(fù)制時(shí)間過長(zhǎng)，復(fù)制成功率不穩(wěn)定。在不同腫瘤類型中，復(fù)制PDX 模型成功率存在較大差異，通常失敗率較高，不能用于篩選免疫相關(guān)類藥物[25]。

綜上所述，近年來PDX 模型越來越被重視，雖然存在一些局限性需要進(jìn)一步加以解決，但是其保存腫瘤細(xì)胞的原始微環(huán)境，繼承原發(fā)腫瘤的所有分子生物學(xué)特性并保留腫瘤異質(zhì)性，優(yōu)勢(shì)明顯。PDX 模型被證實(shí)是一個(gè)很有價(jià)值的研究工具，未來會(huì)在臨床前藥物測(cè)試、新藥開發(fā)、個(gè)體化藥物篩選、腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物的研究及精準(zhǔn)醫(yī)療等方面帶來新的突破。